小鼠新型诱导多能性干细胞的构建及分化潜能的研究

摘要

2006年日本科学家山中伸弥(Shinya Yamanaka)首次利用病毒载体将四个转录因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)的组合转入体细胞中，成功建立小鼠诱导多能性干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs)。实验证明iPSCs已经可以分化为心肌细胞、视网膜细胞以及造血细胞等，对临床研究具有极大意义。本研究室以自主开发的新型干细胞诱导技术为基础[1]，将小鼠iPSCs放入添加四种生物活性因子ABCL(Activin A,BMP4,CHIR99021和mLif)的基础培养液中，使其诱导为一种更具多能性的新型干细胞（iPSC-advanced pluripotent stem cells，iPSC-ASCs）。
　　实验结果如下：
　　1、通过脂质体将六种转录因子Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc,Rarg及Lrh1的组合转入小鼠胎儿成纤维细胞(MEF),使其成功转化为iPSCs。两种不同iPSCs系在ABCL中培养，诱导出iPSC-ASCs，其AP染色均为阳性，与iPSCs无显著差异。
　　2、免疫荧光染色检测了胚层分化基因Cdx1、Sox17、以及细胞周期调控因子c-Myc在蛋白水平的表达。结果显示所用的两种iPSC-ASCs细胞系的Cdx1和c-Myc蛋白表达均比对照组iPSCs高。
　　3、RT-qPCR结果显示，iPSCs和iPSC-ASCs的多能性基因Oct4，Sox2，Nanog表达与MEF相比均显著提高。而且在形态扁状的Flat-iPSCs(F-iPSCs)诱导出的F-iPSC-ASCs中，发现Oct4,Sox2,c-Myc,T,K18,Gata4基因与iPSCs相比表达均上升，而在形态圆状的Round-iPSCs(R-iPSC)及R-iPSC-ASCs中未得到同样的结果。
　　4、通过嵌合体制备检测iPSC-ASCs的发育潜能。实验结果显示iPSC-ASCs细胞系可贡献到10.5天的胎儿和卵黄囊，又可贡献到胎盘，而且iPSC-ASCs细胞系可进入13.5天胚胎的生殖嵴。
　　5、把iPSC-ASCs和iPSCs直接培养在基础培养基N2B27中，观察其分化状态。在培养到第六天，iPSC-ASCs和iPSCs基本全部分化，相对于iPSCs，iPSC-ASCs更容易向中胚层分化。
　　综上所述，本实验利用化学成分明确的培养条件建立了的iPSC-ASCs与iPSCs相比，在基因表达水平和发育潜能等方面，iPSC-ASCs更具有多能性，是一种新型诱导多能性干细胞系。

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