胸膜肺炎放线杆菌IV型菌毛亚单位ApfA基因的表达及其免疫原性分析

摘要

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌所引起的一种以胸膜肺炎和出血性坏死性肺炎为主要特征的呼吸道传染病。最近，人们在胸膜肺炎放线杆菌中发现了菌毛，研究表明该菌毛属于Ⅳ型A组菌毛家族。粘附通常被认为是APP在宿主上皮细胞定居的第一步，有报道指出：除脂多糖外，一些其它的粘附素也可使胸膜肺炎放线杆菌粘附于粘膜表面。根据对菌毛特性及功能的研究，人们推测所谓的“其它粘附素”很可能就是菌毛。菌毛主要由菌毛蛋白构成，有很强的抗原性，可刺激机体产生相应的抗体。菌毛亚单位基因apfA在12个典型的胸膜肺炎放线杆菌血清型中均有存在，且每个血清型菌株apfA的ORF长度均为444bp,其同源性则高达98％以上，证明apfA是高度保守的。因此根据apfA的以上性质，可以设想加入了菌毛的APP疫苗不仅能提供对同型菌株感染的保护，而且还可能提供对异型菌株感染的交叉保护作用。本实验参照GenBank中猪胸膜肺炎放线杆菌血清型7型apfA3’末端444bp的特异片段序列设计引物，以猪胸膜肺炎放线杆菌血清型7型25-4菌株基因组DNA为模板，扩增apfA特异性基因片段。序列分析结果表明：25-4菌株与标准7型apfA基因同源性达98.6％。将apfA片段按正确的阅读框架克隆入pGEX-6P-1载体中，用IPTG诱导实现其在大肠杆菌中的表达。经SDS-PAGE电泳结果显示，表达的融合蛋白约为42kDa，以包涵体的形式存在。Westernblotting检测其结果表明，GST-ApfA融合蛋白具有较强的免疫活性。在经过变性、复性及纯化后，将GST-ApfA融合蛋白作为抗原免疫小鼠，制备抗血清，ELISA方法检测抗体滴度，结果证明GST-ApfA融合蛋白可以有效地诱导小鼠产生特异性抗体，GST-ApfA融合蛋白具有很好的免疫原性。

目录

前言

一、猪传染性胸膜肺炎研究进展

(一)病原学

(二)胸膜肺炎放线杆菌的主要毒力因子及其致病性

(三)流行病学

(四)病理变化

(五)主要临订症状

(六)诊断

(七)防制

二、胸膜肺炎放线杆菌Ⅳ型菌毛研究进展

实验一apfA特异性基因片段的克隆和表达

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、小结

实验二ApfA重组蛋白包涵体的裂解复性及其免疫活性鉴定

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、小结

实验三GST-ApfA融合蛋白免疫原性分析

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、小结

结论

参考文献

附录

一.apfA特异性基因片段测序报告

二.缩略词

致谢

攻读学位期间发表的学术论文