PAK1重组蛋白的表达及其在细胞内的定位

摘要

目的：本研究通过观察PAK1重组蛋白在原核细胞中的表达情况及PAK1在真核细胞中的定位，为进一步研究PAK1的生物学性能提供理论和实验基础。　　方法：1.总RNA提取及cDNA合成：总RNA提取按照RNA提取protocol操作完成；在M-MuLVReverseTranscriptase作用下逆转录为cDNA。2.以cDNA为模板扩增PAK1依据PAK1序列，设计2对引物，建立PCR反应体系，扩增PAK1。3.重组质粒的构建将PAK1基因克隆到GST融合蛋白原核表达载体pGEX-5X-1中，构建重组质粒pGEX-5X-1/PAK1；同时，利用基因重组技术将PAK1基因克隆到GFP融合蛋白真核表达载体pEGFP中，构建重组质粒pEGFP/PAK1。4.GST-PAK1融合蛋白表达用pGEX-5X-1/PAK1重组质粒转化大肠杆菌BL21，进行SDS-PAGE电泳。5.WesternblottingSDS-PAGE电泳结束后将两块凝胶分别转移至2张PVDF膜上，其中一张膜加入用TBST稀释的抗辣根过氧化物酶GST抗体，压片显影。另一张膜加入用TBST稀释的PAK1抗体，压片显影。6.用荧光显微镜方法观察PAK1在细胞内的定位。　　结论：PAKl原核表达质粒构建成功，PAKl重组蛋白可成功的在原核细胞中表达，PAKl定位于胞浆。为进一步研究PAKl生物学特性奠定基础。

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