PAK1磷酸化P21waf1/Cip1影响其在胃癌细胞中的定位及表达

摘要

目的：
　　 胃癌是我国最常见的恶性肿瘤，其发病率在我国近年来持续上升。因此胃癌发病机制及其诊断治疗的研究是我国目前肿瘤研究的一个重要课题。激酶在细胞信号转导过程中起到枢纽作用，这使它们在许多种肿瘤的治疗中成为有效的药物作用靶点。PAK1(P21-activated kinase1)是一保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，研究表明PAK1可以被很多种细胞外刺激因子激活，通过磷酸化下游靶蛋白参与众多的生物学功能，如:细胞骨架重组、细胞周期演进、凋亡与存活、基因转录调节及癌细胞侵袭转移等。
　　 p21WAF1/Cip1最初被描述为p53依赖性肿瘤抑制子调节DNA的复制和抑制细胞周期。如今它被确认执行多种其他的功能，如转录调控和调节细胞增殖等。p21蛋白在细胞内的定位不同，其参与的信号通路和细胞进程也不相同。在细胞核中p21参与细胞周期的负向调控，作为胞周期蛋白激酶复合物及转录因子抑制DNA的复制影响细胞增殖。与此相反，细胞质p21可促进细胞增殖，抑制凋亡。这表明，在细胞核中p21基因是一种抑癌基因，在细胞质中p21基因是一种癌基因。
　　 近年来，p21的磷酸化位点被逐一发现，其中p21的C末端PCNA结合区上T145和S146位点磷酸化与其细胞定位及稳定性密切相关，是多种细胞内信号蛋白激酶的作用靶标。Akt参与调节细胞的增殖和生存，作为磷酸肌醇3-激酶(PI3K)的下游，在受体刺激后活化。p21的T145残基是Akt磷酸化位点RxRxxS/TF的组成部分。Pim蛋白家族成员Pim-1磷酸化p21的T145可使其稳定，磷酸化S146导致p21蛋白的亚细胞定位的转变，在H1299细胞中显著定位于细胞质中。蛋白激酶A(PKA)也已经证实能够在体外磷酸化T145残基，p21被PKA磷酸化修饰导致p21稳定性降低。
　　 本研究在王桂玲导师前期工作的基础上，体外实验证实PAK1对p21的磷酸化，同时以胃癌细胞系为研究对象，进一步证实PAK1调节细胞内p21的磷酸化，并下调p21的表达。利用突变体检测T145和S146在p21定位中的作用，为进一步探讨PAK1及p21在胃癌中的作用提供新的思路和线索。
　　 方法：
　　 1、体外激酶实验检测PAK1磷酸化p21。
　　 2、体外激酶实验检测随着PAK1浓度的改变p21的T145和S146磷酸化情况。
　　 3、共聚焦显微镜观察PAK1对p21定位的影响。
　　 4、共聚焦显微镜检测p21的T145及S146突变体在SGC-7901细胞中的定位情况。
　　 5、利用p21的T145和S146位点的磷酸化抗体，Western Blot验证PAK1对p21表达的影响。
　　 6、在不同胃癌细胞系中，当PAK1被shRNA干扰时，Western Blot检测p21及磷酸化p21表达情况。
　　 结果：
　　 1、体外激酶实验证实PAK1能够磷酸化p21的S146位点。
　　 2、共聚焦显微镜观察显示PAK1能引起p21向细胞质移位。
　　 3、共聚焦显微镜观察显示p21-WT，T145A、T145D、S146A及T145A&S146A主要定位在细胞核，而S146D及T145D&S146D型主要定位在细胞质。当与PAK1共转染后，发现p21-WT，S146A及T145A&S146A主要定位在细胞核，p21-T145A、T145D、S146D及T145D&S146D定位在细胞质。
　　 4、Western Blot实验证实转染不同剂量的PAK1，随着PAK1浓度的增多，p21的总蛋白及S146磷酸化表达减少，而T145位点磷酸化p21表达未发现改变。
　　 5、当PAK1被shRNA干扰时，在SGC-7901细胞中p21的总蛋白及S146位点磷酸化表达升高;在MGC-803细胞中p21的总蛋白及S146磷酸化表达为发现改变;而在AGS细胞中p21的总蛋白及S146磷酸化表达减少。
　　 结论：
　　 1、PAK1磷酸化p21的S146位点。
　　 2、过表达的PAK1时能够引起p21核质移位。
　　 3、过表达的PAK1能够下调p21的总蛋白及S146磷酸化表达，而未改变145位点磷酸化表达。
　　 4、PAK1被shRNA干扰时，不同胃癌细胞系中，对p21表达产生不同影响。

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