Survivin在肾癌组织中的表达及Survivin反义寡核苷酸诱导肾癌细胞凋亡及机制的研究

摘要

肿瘤是一类细胞增殖周期紊乱性疾病，细胞增殖和凋亡的失衡可以导致肿瘤的发生和发展，对细胞周期的调控在肿瘤的发生和治疗中起重要作用。不可控制的细胞增殖是癌症的特征。恶性肿瘤的增殖从生物学角度看主要表现在两个方面：一方面是肿瘤细胞的“不灭性”，即凋亡障碍；另一方面是细胞分裂的失控，即细胞周期网络调控系统的障碍。Survivin是近来分离的哺乳动物凋亡抑制剂，具有与其他凋亡基因不一样的特性，即在良好分化的正常组织中不表达，但是广泛表达于各种肿瘤组织。它在肿瘤中高表达反映了凋亡抑制在肿瘤进展中的作用，而它在有丝分裂中的作用引起了人们对于细胞增殖和细胞凋亡的兴趣。 目的通过免疫组化和RT-PCR方法检测了Survivin在肾癌组织和肾癌细胞系中的表达情况，通过反义寡核苷酸技术，观察了其对肾癌细胞凋亡的影响，探讨其对肿瘤细胞影响的途径。 方法：(1)应用免疫组化方法检测66例肾癌患者和20例正常肾组织中Survivin的表达情况，应用RT-PCR和Westernblot检测6例肾癌组织，6例正常肾组织及两种肾癌细胞系786-0和ACHN中SurvivinmRNA的表达情况。(2)通过脂质体介导的Survivin反义寡核苷酸技术，采用电镜，免疫组化，westernblot，RT-PCR和流式细胞仪等手段，观察Survivin反义寡核苷酸对肾癌细胞凋亡、增殖的影响。 结果： (1)66例肾癌组织均有不同程度的Survivin表达，主要表达于细胞的胞浆和细胞膜，为浅黄色和棕黄色。20例正常肾组织很少见到Survivin蛋白的表达。肾癌组织和正常肾组织吸光度分别为0.031±0.002和0.875±0.124，两者比较，差异具有显著性意义(p＜0.01)。不同病理类型透明细胞癌，嗜色细胞癌和嫌色细胞癌吸光度值分别为0.873±0.091，0.904±0.103和0.813±0.126，各类型间差异无显著性意义。不同病理分级肾癌组织G1，G2，G3和G4吸光度值分别为0.693±0.092，0.762±0113，0.876±0.106和0.903±0.092，各级间比较，差异具有显著性意义(p＜0.05)。不同肾癌临床分期Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ、Ⅳ吸光度值分别为0.864±0.121，0.884±0.093和0.853±0.106，各期间比较，差异无显著性意义。Westernblot和RT-PCR检测结果显示，正常肾组织表达阴性，肾癌组织和两种肾癌细胞系786-0和ACHN均有不同程度的Survivin蛋白和mRNA表达，统计学表明差异有显著性意义。 (2)SurvivinASODN转染后肾癌细胞超微结构的变化：转染结束后可见细胞皱缩，细胞膜微绒毛消失，染色质浓缩，致密的凋亡小体亦较多。免疫细胞化学染色显示survivn蛋白阳性颗粒定位于细胞质，呈淡黄至棕黄色染色；空白对照组和SODN组染色较强，而ASODN组明显减弱。各组细胞均有不同程度的特异性Survivin基因条带表达，空白对照组和正义对照组表达最强，而ASODN组表达相对较弱。RT-PCR结果与空白对照组和正义对照组相比，ASODN组表达明显下调(P＜0.05)。Westernblot结果也显示，与空白对照组和SODNSurvivin蛋白表达水平相比较，ASODN组表达亦明显下调，差异具有统计学意义(P＜0.05)。流式细胞仪定量检测凋亡细胞，DNA直方图可见转染后二倍体峰(G1期细胞)减少，G1峰左侧出现明显的凋亡峰(亚二倍体峰)，G2/M期呈明显增加趋势。各组细胞凋亡分别为6.05±0.48％，5.70±041％，10.54±0.72％，12.80±0.38％，22.30±1.23％，三组实验组细胞凋亡均较对照组有显著增加。ASODN对细胞凋亡的影响呈浓度依赖关系。经MTT法检测，800ng/mlASODN作用24h，48h和72h后，肾癌细胞抑制率分别为38.5±2.6％，52.9±3.4％和62.2±3.8％，呈现时间依赖关系，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 结论： (1)本研究应用免疫组化的方法在66例肾癌组织和20例正常肾组织检测发现，正常肾组织不表达Survivin，而肾癌组织不同程度表达Survivin蛋白，表明Survivin和肾癌的发生有关。 (2)本研究表明，不同病理类型，不同临床分期间，Survivin的表达差异无显著性意义，Survivin的表达随着分化程度的降低而增高，说明Survivin表达和肾癌的分化程度有关，和肾癌的发展有关，可以用来作为判断肿瘤预后的标志物。 (3)本实验利用反义技术，合成并转染靶向Survivin的反义寡核苷酸，结果表明转染成功后，肾癌细胞系786-0中SurvivinmRNA和蛋白的表达呈现下降趋势。提示可以通过Survivin途径治疗肾癌。 (4)本实验表明Survivin的反义寡核苷酸对肾癌细胞的抑制效应呈现剂量-时间依赖效应，进一步证实了Survivin的反义寡核苷酸治疗肾癌的有效性。 (5)Survivin的反义寡核苷酸通过封闭Survivin的表达，诱导肾癌细胞的生长停滞于G2/M期，使之无法完成有丝分裂，从而抑制肾癌细胞的增殖活性。 (6)Survivin的反义寡核苷酸通过封闭Survivin基因的表达导致Caspase-3的激活，从而促进肾癌细胞的凋亡。

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论文一Survivin在肾癌组织和肾癌细胞系中的表达及意义

论文二Survivin反义寡核苷酸诱导肾癌细胞凋亡及机制的实验研究

综 述Survivin与肿瘤细胞的凋亡

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