TLR2、4在内毒素血症幼鼠肠损伤的作用机制和谷氨酰胺与肠三叶因子保护机制的研究

摘要

肠粘膜屏障包括机械屏障、生物屏障和免疫屏障，三者共同构成一道严密的保护层，在阻止肠腔内细菌、毒素进入机体并维持机体内环境稳定上起重要作用。因此，目前认为肠道功能障碍是导致多器官衰竭的重要因素之一。 感染、败血症是儿科常见病之一，其危重症常伴发胃肠功能障碍，出现腹胀、肠鸣音减弱或消失等症状体征。此时，常提示病情加重和预后不良，晚期病死率极高。肠粘膜受损致屏障功能障碍是肠功能衰竭发生的病理机制之一。因此，对其机制研究并探讨有效的保护措施成为研究的重点。 内毒素血症可通过缺氧、炎症介质释放、自由基增多使肠粘膜屏障受损，致使大量细菌易位，引起远隔器官感染，最终造成多器官功能衰竭，甚至死亡。TLR能够识别外源性微生物，在病原体入侵机体时启动先天性免疫反应，清除侵入的病原微生物。TLR胞内区结构与白介素-1受体(Interleukin-1 Receptor，IL-1R)高度同源，称为TIL区(TLR/IL-IR homologous region)。LRR是蛋白质和蛋白质相互作用的结构基序，可以直接识别和结合病原体或其产物，激发机体的非特异性免疫反应。与IL-IR同源的胞内区与核转录因子-kB(NF-KB)的激活有关。 谷氨酰胺(Glutamine，Gln)是机体含量最丰富的条件氨基酸，是许多快速分裂细胞，如肠上皮细胞，淋巴细胞等的能源物质，也是合成核苷酸的前质，可促进蛋白质的合成和抑制蛋白质的降解，因此，Gln是维持肠道粘膜代谢、结构和功能的必需营养物质，对维护肠粘膜的细胞生长、分化和增殖以及维持肠道粘膜上皮的完整性具有重要意义。但以往对Gln在肠粘膜功能上的作用，主要集中在营养方面，而对Gln减少炎症介质释放的作用机制并未阐明。 肠三叶因子(Intestinal trefoil factor，ITF)是三叶肽家族成员之一，广泛存在于胃肠道，具有特征性的三叶结构。为此，本研究以LPS诱导内毒素血症，致幼鼠肠损伤为对象，探讨TLR在肠损伤的作用机制及谷氨酰胺和肠三叶因子在肠损伤的保护机制。 实验材料与方法: 一、动物模型及分组 Wistar健康10同龄幼鼠，雌雄不限，体重15-25g，由中国医科大学附属二院医学动物实验中心提供。以LPS 5mg/kg腹腔注射的方法制备Wistar幼鼠内毒素血症的模型。72只幼鼠以腹腔注射药物的不同，分为NS组、LPS组、Gln组和ITF组。 二、标本采集和处理 NS组、Gln组、ITF组均于腹腔注射后3h，LPS组分别于腹腔注射后3、6、12、24、48、72h给予10％水合氯醛腹腔注射麻醉，处死，并按要求处理和保存。 三、实验方法: 1、动态观察幼鼠的一般状态和死亡情况。 2、病理形态学研究。 四、统计学分析所有数据均以均值士标准差(-x±S)表示，差异比较用SPSS13.0统计软包进行方差分析，组间比较用LSD法检验及制作统计图。 结果: 一、幼鼠的一般状况对照组 动物腹腔注射NS后进食、活动正常。LPS组动物在腹腔注射LPS后出现腹泻、腹胀明显等胃肠功能障碍症状，死亡率约8.3％。而Gln组和ITF组上述临床症状较内毒素组轻，无死亡。 二、幼鼠肠组织病理学变化: 1、大体观察：LPS组动物在腹腔注射LPS后3h可见肠管、肠系膜轻度充血肿胀，6h时可见充血肿胀明显，有胃潴留，部分肠管扩张，肠腔内有出血；12h上述症状明显，24h仍有胃潴留及肠管充血，72h上述症状有好转。Gln组和ITF组以上症状较内毒素组轻，NS组无明显变化。 2、光镜变化：NS组肠绒毛完整，无明显异常改变。LPS组给予LPS后3h肠组织可见明显异常；6h见间质水肿吸收，充血不明显，杯状细胞增加，上皮细胞仍水肿，细胞内出现玻璃样物质，呈透明样变；12h上述变化更加明显；24h可见绒毛间质、上皮细胞水肿明显减轻，杯状细胞仍较多：48h上述改变明显恢复；72h恢复明显。Gln组和ITF组有绒毛间质轻度充血，无明显水肿，细胞轻度水肿，较LPS组明显减轻，杯状细胞明显增加。 3、电镜变化：NS组上皮细胞柱状，核呈卵圆形，顶部微绒毛排列整齐，细胞间紧密连接完整，内质网及线粒体清晰；内毒素作用下顶部微绒毛疏松，轻度水肿，微绒毛排列不整、部分断裂、缺失，部分紧密连接增宽或断裂，细胞核固缩，形成凋亡小体，染色质边聚。LPS作用后3h既有改变，至24h细胞损伤达到高峰，72h有所恢复。 三、幼鼠肠组织TNF-α、IL-4、IL-10的变化腹腔注射LPS后3h肠组织TNF-a、IL-4、IL-10分泌明显增加，较NS组有显著差异(P<0.05)，TNF-α增加更为明显；TNF-α、IL-4、IL-10分泌均于6h达到高峰，于12h有所下降，24h肠组织TNF-α稍高于NS组(P>0.05)，IL-4、IL-10又明显增加(P<0.01)，至72h下降；Gln组和ITF组肠组织TNF-α、IL-4、IL-10明显低于LPS组，差异非常显著(P<0.01)。 四、幼鼠肠组织TLR2、4和NF-kBmRNA表达的变化在NS组TLR2 mRNA表达较弱，TLR4 mRNA表达较明显，NF-kB mRNA稍有表达。TLR2 mRNA在LPS组各时间点表达明显高于NS组，且差异非常显著(P<0.01)；TLR2 mRNA表达逐渐增高，于72h达高峰。TLR4 mRNA表达在LPS腹腔注射3h即达到高峰，显著高于NS组(P<0.01)，然后下降；于24h、48h又复增高；于72h明显下降，且低于NS组，差异显著(P<0.01)。NF-kB mRNA表达在LPS腹腔注射3h即达到高峰，显著高于NS组(P<0.01)，然后下降，明显低于NS组，差异显著(P<0.05)；于24h、48h又复增高，明显高于NS组，差异非常显著(P<0.01)；于72h明显下降，且低于NS组，但无明显差异(P>0.05)。 五、Gln对幼鼠肠组织TLR2、4和NF-kB mRNA及蛋白表达的影响1、NS组TLR2表达较弱，LPS组TLR2表达明显增强，谷氨酰胺组TLR2表达明显弱于LPS组，差异显著(P<0.05)。TLR4在NS组有一定的表达，LPS组表达显著上调，差异非常显著(P<0.01)，谷氨酰胺组表达明显下调，差异非常显著(P<0.01)。NF-kB在NS组表达非常弱，LPS组表达明显增高，差异显著(P<0.05)，谷氨酰胺组明显下调，差异非常显著(P<0.01)。 六、Gin对幼鼠肠组织TNF-α、IL-4、IL-10的影响LPS组TNF-α，IL-4，IL-10较NS组明显增高，差异显著(P<0.05或P<0.01)；Gln组TNF-α，IL-4，IL-10较LPS组明显降低，差异非常显著(P<0.01)。Gln组IL-4，IL-10也明显低于NS组，差异非常显著(P<0.01)。 七、ITF对幼鼠肠组织TLR2、4和NF-kB mRNA及蛋白表达的影响1、TLR2 mRNA表达LPS组较NS组明显增高，差异非常显著(P<0.01)，ITF组较NS组、LPS组均明显增高，且差异非常显著(P<0.01)。肠组织TLR4、NF-kBmRNA表达在LPS组均也较NS组明显增高，差异非常显著(P<0.01)，ITF组TLR4、NF-kB mRNA表达均较LPS组明显降低，差异非常显著(P<0.01)，且均低于NS组，TLR4降低更为明显，差异显著(P<0.01)。 八、ITF对幼鼠肠组织TNF-α，IL-4，IL-10的影响LPS组肠组织TNF-α较NS组明显增高，差异非常显著(P<0.01)，ITF组TNF-α较LPS组明显降低，差异非常显著(P<0.01)。肠组织IL-4，IL-10在LPS组较NS组显著增高，差异非常显著(P<0.01)，ITF组IL-4，IL-10较LPS组、NS组均明显降低，差异非常显著(P<0.01)。 结论:1、LPS可引起幼鼠肠组织损伤，光镜和电镜均有不同程度的改变。Gln和rlTF可减轻病理变化，对肠组织损伤有保护作用。 2、在内毒素血症早期肠组织TNF-α，IL-4，IL-10均明显增高。随LPS作用的时间延长，TNF-α下降，IL-4，IL-10再次增高，呈双峰现象，这可能有利于抑制炎症反应，减轻炎症介质对肠粘膜的损伤。 3、在正常肠组织中，TLR2与NF-kB mRNA和蛋白有较弱的表达，TLR4mRNA和蛋白有稍强的表达。LPS可使肠组织TLR2 mRNA和蛋白明显上调，并随着LPS作用时间的延长，TLR2上调更加明显。在LPS作用早期TLR4与NF-KBmRNA和蛋白表达明显上调，随之下降，并随LPS作用的时间延长，再次增高，呈双峰现象，同抑炎因子IL=4，IL-10的分泌吻合，TLR4可能有促进IL-4，IL-10分泌的作用。 4、Gln通过下调内毒素血症肠组织TLR2、4和NF-kB mRNA及蛋白表达，降低了TNF-α分泌，明显减轻了肠组织的损伤。 5、rITF通过抑制内毒素血症肠组织TLR4和NF-kB mRNA及蛋白表达，降低了TNF-α分泌，减轻了LPS对肠组织的损伤。 6、TLR2、4与NF-KB蛋白表达在正常对照组和LPS组与TLR2、4与NF-kBmRNA表达相一致。

目录

论文说明：英文缩略语

声明

中文论著摘要

英文论著摘要

前言

论文一:TLR2和TLR4mRNA在内毒素血症幼鼠肠组织的表达与肠损伤的关系

前言

实验材料及方法

结果

论文图片

讨论

结论

论文二:谷氨酰胺对内毒素血症幼鼠肠组织TLR2、4mRNA和蛋白表达的影响与肠损伤关系的研究

前言

实验材料及方法

结果

论文图片

讨论

结论

论文三:肠三叶因子对内毒素血症幼鼠肠组织TLR2、4mRNA和蛋白表达的影响与肠损伤关系的研究

前言

实验材料及方法

结果

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讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述:TLR与兔疫反应的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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