CYP2C9对氯胺酮代谢的催化作用及基因多态性对其药代动力学的影响

摘要

本研究主要是通过应用特异性底物和酶抑制剂证实CYP2C9氯胺酮的催化作用，并筛查CYP2C9基因多态性，探讨不同基因型的个体对P450酶含量以及CYP2C9酶活性的影响和对氯胺酮催化作用的差异。这一研究对阐明氯胺酮的代谢机制和预测氯胺酮代谢的个体差异具有重要的临床意义。目前国内外还没有相关报道。 实验材料 一、实验主要试剂和药品 氯胺酮标准品(上海邦宇生物科技有限公司，含量99.99％) 布比卡因标准品(上海邦宇生物科技有限公司，含量99.99％) 磺胺苯吡唑标准品(Sigma公司，美国，含量99.9％) 甲苯磺丁脲标准品(Sigrna公司，美国，含量99.9％) DNA提取试剂盒购自美国GENTEST PCR引物、PCR所需试剂等均购自上海生工生物工程技术有限公司 MAKER购自大连宝生物公司 NSiI购自华美生物公司 二、实验主要仪器器材 HP1160型高效液相色谱仪(美国惠普公司) G1311型四元泵(美国惠普公司) G1314A型紫外检测器(美国惠普公司) G1322A型真空脱气机(美国惠普公司) G1316A型柱温箱(美国惠普公司) Hypersil ODS2色谱柱(4.6mm×150mm，5μm，大连依利特) UV300紫外可见光分光光度计(Pye-unicam/spectronic，英国) Power Pac 1000电泳仪(Bio-Rad，美国) Gene Amp PCR System 9700 PCR仪(Perkin-Elmer，美国)BIS 303PC电泳凝胶成像系统(DNR，以色列) 实验方法： 一、CYP2C9对氯胺酮代谢的催化作用 本研究进行人体组织实验己获得中国医科大学伦理委员会的批准。20例人体肝脏组织分别来自中国医科大学附属第一医院、中国医科大学附属盛京医院和沈阳军区陆军总院普外科肝脏部分切除手术，取直径为1～2cm的正常肝脏组织(经病理形态学证实)，10 min内液氮冰冻，-70℃冰箱保存备用。肝脏微粒体通过差速离心法制备，微粒体部分重悬于含有20％(v/v)甘油的磷酸钾缓冲液中，-70℃冰箱保存。以牛血清白蛋白做标准曲线，应用改良的Lowry’s法测定微粒体内的蛋白含量。 孵育条件：孵育混合液包括0.4mg/ml微粒体稀释液，100mM磷酸钾缓冲液(PH7.4)和在聚乙烯试管中孵育过的0.5mL底物，37℃水浴摇床先预孵育3min，反应从加入1mM NADPH辅酶再生系统(0.5 mmol/L NADP+，5 mmol/L，G6P，unit/ml G6PDH，6 mmol/L MgCl2)开始，分别孵育0，5，10，20，40，60min。各管中加入1ml 0.1M的冷NaOH放入-20℃冰箱中止反应。 采用高效液相色谱法(HPLC)测定各时点氯胺酮的浓度。与CYP2C9的特异底物甲苯磺丁脲和抑制剂磺胺苯吡唑作相关分析。荧光检测波长为211nm，流速1ml/min，流动相：乙腈：0.025mol/I KH2PO4：三乙胺(40：60：0.02) 二、CYP2C9基因多态性对P450酶含量和CYP2c9活性的影响 203例病例分别来自中国医科大学附属第一医院、中国医科大学附属盛京医院和沈阳军区陆军总医院2006年1月至2007年1月期间普外科行肝脏部分切除手术的患者，汉族，静脉采血2ml用于DNA提取以及基因型测定。筛选出的不同基因型患者(CYP2C9野生型和突变体)，比较肝微粒体内P450酶的含量和对CYP2C9活性探针甲苯磺丁脲的代谢速率的影响。 三、CYP2C9基因多态性对氯胺酮药代动力学的影响 203例病例来源和基因分型工作同实验二。筛选出不同基因型患者(CYP2C9野生型和突变体)，比较肝脏微粒体氯胺酮的代谢速率。肝脏微粒体代谢氯胺酮的方法同实验一。 四、药代动力学分析及统计学处理 数据以-x±SD表示。肝脏微粒体中氯胺酮的代谢速率可通过下面公式计算，其中C为氯胺酮在孵育液中的初始浓度，t1/2为氯胺酮在孵育液中的消除半衰期：消除速度R=C×0.693/t1/2，氯胺酮消除半衰期是从各时间点氯胺酮剩余浓度的均值对时间作半对数图形进行线性相关分析计算而得。数据处理采用SPSS11.5。不同基因型组间P450酶含量和氯胺酮代谢速率的比较采用配对t检验。P<0.05认为差异有显著性。 结果： 一、肝脏微粒体体外孵育氯胺酮各时点氯胺酮浓度的测定 HPIC结果表明，在实验测定范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系。在本实验条件下，氯胺酮及内标布比卡因分离完全，不受微粒体孵育液中内源性物质的干扰。其保留时间分别为3.4min和5.8min。检测精密度、准确度、提取回收率均符合生物样品检测要求。 二、氯胺酮代谢速率的测定 20例人肝脏微粒体中氯胺酮的代谢速率相差最大约一倍(5.4-11.2)，平均为8.2nmol.min-1.mg-1 protein(7.3-10.8)。该速率与CYP2C9活性探针甲苯磺丁脲代谢速率呈明显相关性(r=0.886，P<0.01)。加入特异性抑制剂磺胺苯吡唑组，氯胺酮的平均代谢速率都明显低于正常孵育对照组(P<0.01)，为5.4nmol·min-1.mg-1protein(4.97～5.89)，抑制率为33.6％。 三、CYP2C9基因分型 所有样本PCR扩增产物均为一长度170bp的特异性片段。CYP2C9突变型的PCR产物有一个NSiI的酶切位点，经酶解后被切成140bp和30bp两个片段。野生型则不能被切开。203例基因分型检出野生型196例，突变型杂合子7例，突变型纯合子未能检出。 四、CYP2C9基因多态性对P450酶含量的影响 P450含量测定范围符合测定标准0.4-1.0nmol/mg。7例野生型个体和7例突变型个体组平均P450酶含量分别为0.81nmol/mg和0.76nmol/mg，两组比较没有统计学差异。(P<0.05) 五、CYP2C9基因多态性对CYP2C9酶活性的影响 7例野生型个体和7例突变型个体组甲苯磺丁脲的代谢速率分别为1.7nmol·min-1·mg-1 protein和0.6nmol·min-1·mg-1 protein，两组比较有显著性差异。(P<0.01) 六、CYP2C9基因多态性对氯胺酮代谢速率的影响 7例野生型和7例突变型个体组氯胺酮的代谢速率分别为7.9nmol·min-1·mg-1 protein(7.1-9.8)和5.3nmol·min-1·mg-1 protein(4.8-6.2)，两组比较有显著性差异。(P<0.05) 结论： 1、CYP2C9对氯胺酮代谢具有催化作用，其抑制剂使氯胺酮的代谢速率减慢。 2、CYP2C9基因多态性对肝微粒体P450酶含量没有显著影响，CYP2C9基因多态性降低了CYP2C9的酶活性。 3、CYP2C9基因多态性对氯胺酮代谢动力学具有显著影响，检测突变型个体对指导临床合理用药和个体化医疗具有重要意义。

目录

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中文论著摘要

英文论著摘要

前言

论文一 CYP2C9对氯胺酮代谢的催化作用

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

论文二 CYP2C9基因多态性对P450酶含量和CYP2C9活性的影响

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

论文三 CYP2C9基因多态性对氯胺酮药代动力学的影响

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述：细胞色素P450CYP2B6、CYPC9、CYP3A4的药理作用及基困多态性研究现状

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