疟疾传播阻断疫苗免疫效应机制的实验研究

摘要

本文以酵母菌(S．cerevisiae)表达的传播阻断疫苗候选蛋白Pvs25和Pvs28免疫小鼠，并对小鼠免疫后的应答特点进行了全面系统的研究，以期明确该疫苗的免疫活性。由于啮齿类疟原虫与人类疟原虫具有相似的生物学性状，所以同时也用该酵母菌表达的约氏疟原虫(P．yoelii)动合子表面蛋白Pys25对小鼠进行免疫，通过对其免疫活性、免疫机制以及免疫血清传播阻断效应的观察，进一步证明了传播阻断疫苗的效应分子和作用机制。 研究方法： 一、采用ELISA法检测Pvs25、Pvs28重组蛋白免疫前后DBA2d小鼠血清中特异性IgG的水平尾尖采集初次免疫前和免疫后不同时间小鼠血液，分离血清。分别以溶于碳酸盐缓冲液的Pvs25重组蛋白(200ng/孔)，Pvs28重组蛋白(100ng/孔)包被96孔酶标板，4℃过夜；用含1％BSA的PBS封闭lh，以TBS缓冲液1：200倍稀释免疫后不同时间的小鼠血清，每孔加100μl，室温孵育2h，加1：5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG孵育1h，加底物溶液。酶标仪检测490nm处OD值。 二、采用ELISA法检测Pvs25、Pvs28重组蛋白免疫DBA/2小鼠前后血清中特异性IgG亚类的水平将1：200倍稀释后不同时间段的特异性血清加入预包被好的96孔培养板中，100μl/孔，室温孵育2h，分别加入浓度500ng/ml、250ng/ml生物标记的大鼠抗小鼠IgG1及IgG2a检测抗体，100μl/孔，37℃孵育1h；加入亲和素37℃孵育1h，加底物，避光30min后终止反应，酶标仪检测450nm处OD值。 三、采用双抗体夹心ELISA法检测Pvs25、Pvs28重组蛋白免疫DBA/2dx鼠前后脾细胞培养上清中的细胞因子分别于免疫前及初次免疫后第14d、28d、42d、56d、70d、84d、98d和112d，常规无菌取小鼠的脾脏，制备浓度为1×10<'7>/ml脾细胞悬液，于24孔培养板中培养48h后，收集培养上清，用双抗体夹心ELISA试剂盒(R&D公司)分别检测IFN-γ、IL-4和IL-10产生水平。酶标仪测定450nm处的OD值。应用SoftMax Pro 4.3.1 LS软件分析，绘制标准品标准曲线，计算细胞因子含量(pg/ml)。 四、ELISPOT检测Pvs25、Pvs28重组蛋白免疫DBA/2小鼠后脾脏IFN-γ<'+>和IL-4<'+>细胞数量分别于初次免疫后70d和98d，无菌取小鼠的脾脏，分离小鼠脾脏淋巴细胞，以无血清培养基制备脾淋巴细胞悬液，采用ELISPOT试剂盒对小鼠脾脏IFN-γ<'+>和IL-4<'+>细胞数量进行检测。主要步骤如下：以IFN-γ以及IL-4包被抗体各50g1分别包被70％乙醇予湿后的96孔PVDF膜平板，4℃过夜；加入封闭液37℃封闭1h后，每孔加入脾细胞4x10<'5>个，并分别加入Pvs28或Pvs25重组蛋白，置5％CO<,2>的培养箱中共同孵育24h后弃去细胞，加入生物素标记的IFN-γ或IL-4检测抗体，37~C孵育1h，加入亲和素，37℃孵育1h，显色液100gμ/孔，显色30min，待显示斑点后，用去离子水洗板终止反应， ELISPOT自动分析仪读板，计数IFN-γ<'+>和IL-4<'+>细胞SFC数量(斑点形成数/百万个细胞)。 五、采用ELISA法检测Pys25重组蛋白免疫DBA/2小鼠前后血清中特异性IgG的水平尾尖采集初次免疫前和免疫后不同时间小鼠血液，分离血清。以溶于碳酸盐缓冲液的Pys25重组蛋白200ng/孔包被96孔酶标板，每孔100μl，4℃过夜；用含l％BSA的PBS封闭1h，以TBS缓冲液1：200倍稀释免疫后不同时间的小鼠血清，每孔加1OO μl，室温孵育2h，加1：5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG孵育1h，加底物溶液。酶标仪测490nm处OD值。 六、采用双抗体夹心ELISA法检测Pys25重组蛋白免疫DBA/2小鼠前后脾细胞培养上清中的细胞因子无菌取出于免疫前、初次免疫后第2W和加强免疫后第2W的小鼠脾脏，用含10％FCS的RPMI 1640倍养液常规制备脾细胞悬液，调脾细胞终浓度至1x10<'7>/ml。于24孔培养板上加入脾细胞悬液，500 μl/孔，培养48h，收集上清。用双抗体夹心ELISA试剂盒分别检测IFN-γ和JL-4产生水平。酶标仪测其450nm处OD值，并以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线，计算上清中工FN-γ,UIL-4含量。 七、ELISPoT检测Pys25重组蛋白免疫DBA/2小鼠后脾脏IFN-γ<'+>和IL-4<'+>细胞数量用淋巴细胞分离液分离加强免疫后第2W小鼠脾淋巴细胞，以培养液调淋巴细胞终浓度至4×10<'6>/ml。用JFN-γ以及IL-4包被抗体分别包被96孔PVDF膜板，4℃过夜。以含BSA的PBS封闭1h，加淋巴细胞，4x10<'5>个/孔，每个样本设4个复孔。37℃孵育24h。加生物素标记的IFN-γ或IL-4检测抗体，孵育1h，加亲和素后再孵育1h。加显色液显色30min。ELISPOT自动分析仪读板，计数IFN-γ<'+>和IL-4<'+>细胞数量八、动合子培养和传播阻断效应观察心脏采集P．yoelii17XL(1x10<'6>PRBC)感染的第3dd,鼠血液(肝素抗凝)，分装于1.5ml离心管中，200μl/管，离心，去上清。加入含不同浓度免疫血清的动合子培养液，200 μl/管。24℃培养16h后，取3μl悬液滴于荧光载片上，冷丙酮固定。用含5％脱脂奶粉的PBS 37℃封30min。加酶标羊抗鼠IgG，孵育30min，荧光显微镜观察计数合子和动合子的形成数量。同时设单纯佐剂免疫的小鼠血清为对照。 研究结果： 一、Pvs25、Pvs28重组蛋白免疫DBA/2小鼠前后血清中特异性IgG的水平的变化于初次免疫后第28d，重组蛋白免疫组的工gG水平开始上升。至初次免疫后第112d仍维持于高水平，与免疫前以及佐剂对照组相比差异显著；而对照组的抗体水平在免疫前后则无明显变化。 二、Pvs25、Pvs28重组蛋白免疫DBA/2小鼠前后血清中特异性IgG亚类水平的变化重组蛋白组在初次免疫后第28d，小鼠血清中特异性IgG1以及IgG2a均出现有意义的升高，此后IgG1持续维持在一个较高的水平，至初次免疫后第112d仍无下降的趋势；而IgG2a则于初次免疫后第42d出现下降，且此后进一步下降；而对照组的抗体亚类水平在免疫前后则无明显变化。 三、Pvs25、Pvs28重组蛋白免疫DBA/2小鼠前后脾细胞培养上清中细胞因子的变化。 1、脾细胞培养上清中IFN-γ水平于初次免疫后第14d，小鼠的IFN-γ水平与免疫前相比显著升高，但此后明显下降，并于第42d降至免疫前的水平。在第14d佐剂注射组IFN-γ水平也较免疫前出现了一定的升高，但其升高水平显著低于重组蛋白免疫组。 2、脾细胞培养上清中IL-4和IL-10水平于初次免疫后第28d，重组蛋白免疫组IL-4水平均出现有意义的升高，于第56d达到峰值水平后开始下降，但在112d仍高于免疫前水平。IL-10水平亦于初次免疫后第28d出现有意义的升高，于第42d达到高峰后出现下降，但在112d也仍高于免疫前水平。佐剂组的IL-4、IL-10水平较免疫前无显著变化。 四、ELISPOT检测Pvs25，Pvs28重组蛋白免疫DBA/2小鼠后脾脏IFN-γ<'+>和IL-4<'+>细胞数量疫苗免疫组小鼠的IFN-γ<'+>细胞数量较对照组无明显差异。而IL-4<'+>细胞数量却显著增加，两个时间点的IFN-γ<'+>以及IL-4<'+>细胞数分别与各自组比较无明显差异。佐剂组的IL-4<'+>水平较免疫前无显著变化。 五、Pys25重组蛋白免疫DBA/2小鼠前后血清中特异性IgG的水平变化初次免疫后2W，小鼠血清中IgG出现升高，并于加强免疫后2～3W达到峰值水平。此后开始缓慢下降，但其在20W的水平也明显高于加强免疫前的水平。 六、Pys25重组蛋白免疫DBA/2小鼠后不同时间检测点上的细胞因子水平与免疫前相比，初次免疫后2W，小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4均出现了有意义的升高，但前者的升高水平更为显著；再次免疫后仅见IL-4出现了进一步的升高，而IFN-γ已降至初次免疫前的水平。 七、Pys25重组蛋白加强免疫DBA/2小鼠后脾细胞中IFN-γ<'+>和IL-4<'+>细胞数量与免疫前相比，加强免疫后2W，小鼠脾细胞中IL-4<'+>细胞的数量出现了显著的升高，但IFN-γ<'+>细胞的数量未出现有意义的变化。 研究结论： 1、Pvs25、Pvs28重组蛋白具有较好的免疫活性，免疫DBA/2小鼠后可产生高水平的抗体； 2、Pvs25、Pvs28免疫DBA/2小鼠后产生以的抗体亚类以IgG1为主； 3、Pvs25、Pvs28重组蛋白可诱导DBA/2小鼠产生以Th2反应为主的免疫应答； 4、Pvs25、Pvs28重组蛋白免疫DBA/2后可诱导较强的特异性免疫应答，并具有显著的免疫记忆性； 5、Pys25重组蛋白免疫DBA/2小鼠后诱导小鼠产生的免疫应答类型以Th2反应为主； 6、Pys25重组蛋白具有良好的免疫原性，其免疫血清可显著抑制有性阶段原虫的进一步发育。

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中文论著摘要

英文论著摘要

英文缩略语

论文一 间日疟传播阻断疫苗Pvs25和Pvs28重组蛋白免疫活性的实验观察

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 间日疟原虫重组蛋白Pvs25和Pvs28免疫小鼠应答机制的实验研究

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文三 约氏疟原虫重组蛋白Pys25免疫活性以及免疫血清传播阻断效应的实验观察

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

本文的创新性自我评价

参考文献

综述 疟疾疫苗在不同动物体内免疫效应的观察

在学期间科研成绩

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