PLK1和mTOR激酶在小鼠受精卵早期发育中作用的研究

摘要

对受精卵这一天然的细胞周期模型进行深入研究，有利于揭示细胞周期的调控机制，对生长、发育、癌变、死亡有进一步认识。小鼠受精卵是脊椎动物中与人类种属较为接近的细胞周期模型，但由于取材有限，关于小鼠受精卵早期发育机制的研究，尤其是1细胞期向2细胞期转换，即G2/M期转换机制的研究进展缓慢，因此也成为国际上研究的热点之一． Plks激酶(Plks)是广泛存在于真核生物中的一类丝/苏氨酸蛋白激酶，Plks家族成员较多。在Plks家族中果蝇polo基因是最早被发现的。后来又发现了酿酒酵母(saceharmyces cervisiae)中的cdc5p激酶，芽殖酵母(shizosacchermyces pombe)中的polol激酶，爪蟾(Xenopus)中的Plx1，高等脊椎动物的Plk1，小鼠中的Snk和Fnk，以及人细胞中的hSnk和prk等。 在有丝分裂过程中的不同的几个时期都需要Plks的作用，Plks的活性随时间的变化可以支持这一观点。在哺乳动物细胞Plkl的活性在G2/M转换期迅速增高，几乎与CDK1的活性同时增高。但其活性在CDK1的活性下降后仍保持较高水平。小鼠卵中生发泡破裂(GVBD)前30分钟，Plk1的活性开始升高，在GVBD时达到最高，此后Plk1的活性略有下降，但是在卵的整个成熟过程中仍能保持较高的活性。乙醇活化发生孤雌生殖后Plk1被去磷酸化活性逐渐降低。在进入第一次有丝分裂的M期中的核膜破裂期，Plk1被磷酸化活性有升高。总之，Plks的时空分布、蛋白量及活性变化与其功能密不可分。 在G2/M转换期，Plk据记载定位于SPB周围，而此时MPF复合体也出现在同一位置，并发现在MPF活化时Plks活性升高，因而推测Plks可能参与了MPF在G2/M转换期的激活过程。在爪蟾Plx1被抗体中和后cdc25和MPF活性受到抑制，假如有活性的cdc25可以逆转此趋势，说明Plx1可能参与了cdc25的激活，进而激活MPF。又发现Plx1的激活略晚于MPF，其活性可被CDK的特异性抑制剂完全抑制，可以推测Plx1的激活也依赖MPF的活性。 由此推断MPF可通过激活Plx1间接活化cdc25然后激活更多的MPF，是一个自我催化活化环，并且Plx1参与其中。同时还有研究表明在爪蟾中当Plx1失活时，MPF的抑制性激酶Myt1可被激活而发生超磷酸化，从而抑制cdc2的活化。可以看出Plx1在G2/M转换期既活化了MPF的激活物cdc25又抑制了MPF的抑制物Myt1从而推动了MPF的激活，是细胞分裂进入M期。除了上述的推断外有实验证明Plx1对cdc25的激活作用。Qian(1998)用突变技术将Plx1的Ser125、Thr201残基换为带负电的Asp残基(S128D/T201D)得到有极高Plx1活性的突变体，并将其mRNA注入爪蟾卵中，可直接激活cdc25和MPF。此外Roshak(2000)研究也发现无论免疫共沉淀得到的Plks蛋白还是重组得到的均可直接磷酸化人的cdc25c。 近年来，关于Plk1信号转导途径的报道日益增多，但是有关Plk1在哺乳动物受精卵早期发育过程中作用的报道仍然很少。我们前一部分工作对小鼠1-细胞期受精卵中Plk1的表达及其活性进行了初步观察，发现Plk1的表达和活性在小鼠受精卵早期发育的过程中有变化，因此可能参与G2/M期的转换过程，为了作进一步的研究，通过使用Plk1 shRNA和Plk1的特异性抑制剂scytomenin来抑制Plk1的生物学功能，观察Plk1对于受精卵早期发育的作用，及其的作用途径。 类帕霉素是从土壤吸湿链球菌中分离出来的一种抗生素，结构与大环内酯类抗生素FK506类似，类帕霉素进入体内后与其受体FKBP12结合，然后与另外一种大分子蛋白结合，形成三联复合体，这种大分子蛋白被称为类帕霉素靶(TOR)。TOR首次从酵母中发现，随后在哺乳动物中也发现了TOR的同源蛋白mTOR。mTOR(mammalian target of rapamycin)蛋白是一结构与功能保守的蛋白质，是磷脂酰肌醇激酶相关激酶家族成员，具有丝/苏氨酸激酶活性，是调节细胞生长的中心调控因子。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)参与细胞内一系列生理病理过程，其存在形式主要有两种：mTOR/Raptor复合物和mTOR/Rictor复合物。mTOR/Raptor复合物的发现早于mTOR/Rictor复合物，作用主要是通过调节蛋白质的合成影响细胞生长和增殖，其活性能够被雷帕霉素抑制。mTOR/Rictor复合物的活性不能被雷帕霉素抑制，主要参与细胞骨架蛋白的构造，具体功能仍在进一步研究之中。 众所周知，PKB是调节细胞增殖的重要因子。有报道显示，PKB可以直接磷酸化GSK-3并使其失活，从而促进cyclin D1的核定位，最终激活Cdk4/eyclin D1复合体，推动G1期进程。另一方面，PKB可以将Cdk的抑制因子p21Waf1/Cip1和p27Kip1磷酸化，导致它们定位于细胞浆，并抑制它们的生理功能。这些结果说明PKB通过激活正性调节因子和失活负性调节因子同时促进G1期进程，完成G1/S期转换。同时，PKB还可以有效的调节M期进程。在Rat-1细胞中使用LY294002抑制P13K的活性以后可以引起G2/M期阻滞；当过表达持续激活型PKB或缺失PTEN时，细胞能克服由于γ射线照射引起的G2/M期阻滞。因此，PKB能有效的促进哺乳动物细胞周期中G2/M期转换。我们实验室的前期工作显示，PKB特别是持续激活型PKB，通过影响Cdc2-Tyr15的磷酸化状态促进MPF的活化，参与了受精卵早期发育到2-细胞期的调节过程。 但在小鼠受精卵中，关于mTOR/rictor的作用机制和其信号通路还未见报道。本实验通过观察小鼠1细胞期受精卵中mTOR和PKB的各期活性变化来分析它们之间活性变化的关系，应用Scansite分析软件对小鼠PKB蛋白序列进行分析和预测，并结合现有的mTORC2/PKB的相关报道，确定小鼠PKB蛋白中mTORC2的磷酸化靶位点，通过构建野生型和激酶失活型蛋白激酶B的表达载体及该位点的突变体，并体外转录成mRNA，显微注射入小鼠1 细胞期受精卵，来探讨mTORC2在小鼠受精卵早期发育过程中的可能底物及作用位点，同时为揭示小鼠受精卵早期发育机制提供重要依据。

目录

论文说明：英文缩略语

声明

中文论著摘要

英文论著摘要

论文一 1细胞期中Plk1的表达及活性检测

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

论文二 在小鼠1细胞期受精卵中P1k1通过磷酸化CDC2 Tyr15来调节MPF的活性

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

论文三 mTORC1和mTORC2在小鼠1细胞期受精卵中的表达及对1细胞期受精卵分裂的影响

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

论文四 小鼠受精卵早期发育过程中mTOR/rictor对PKB活性的影响

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述：mTOR有细胞生长过程中的调节过程及其调控因子

附图

在学期间科研成绩

致谢

个人简介