生物防腐剂纳他霉素高产菌株选育、发酵工艺及分离提取技术研究

摘要

纳他霉素(Natamycin)是一种高效、广谱的真菌类抗生素，主要由恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanovgensis)、纳塔尔链霉菌(S.natalensis)和褐黄孢链霉菌(S.gilvosporeus)等经发酵生产，能有效地抑制酵母菌和霉菌的生长，在医疗、食品等方面显示了良好的应用前景。本论文以纳塔尔链霉菌为试材，重点进行了纳他霉素的定量分析方法、菌种诱变和选育方法、发酵工艺及分离提取等方面的研究。 对二剂量管碟法、紫外分光光度法和高效液相色谱法(HPLC)测定纳他霉素的各项参数进行了研究，最终确定高效液相色谱法作为检测发酵液中纳他霉素含量的方法。检测波长：303nm；流动相：甲醇：水：冰乙酸体积比为70：30：2，流速：1.00 mL/min线性回归方程为Y=12500X+12600，R<'2>=0.9995 精密度试验结果：平均RSD为0.753％。当信噪比为3时的最小检测限为31ng。 利用琼脂块法对S. natalensis进行提取，选择了发酵性能较好的SY-4号菌株作为诱变出发菌株，摇瓶产量为1.21g/L。 根据纳他霉素的生物合成途径和代谢调节机理，利用硫酸二乙酯进行化学诱变，分别以硫酸链霉素、纳他霉素和丙酸钠作为抗性筛选剂，获得抗性突变株SY-479，其纳他霉素产量达到1.64g/L。对SY-479进行原生质体紫外线诱变，经硫酸链霉素、纳他霉素和丙酸钠抗性筛选，最终获得纳他霉素高产菌株SY-4795，其摇瓶发酵产量达2.24g/L，较出发菌株生产能力提高147％。 摇瓶发酵结果显示，种子质量对纳他霉素合成具有明显的影响。在孢子培养时间7d、斜面冷藏时间60d以内、接种孢子浓度10<'8>个/mL、种龄32h、接种量2％的条件下，纳他霉素的产量达到最大值，在2.01～2.12 g/L之间。 通过响应面分析，得出摇瓶发酵培养基最佳配方为：葡萄糖41.02g/L、大豆蛋白胨21.09g/L、酵母浸粉4.46g/L、丙酸钠1.89g/L。初始pH值7.5；接种量2％，发酵温度29℃，摇床转速200r/min，发酵120h，发酵产量在2.51～2.68g/L之间。 通过对7 L自动罐分批发酵代谢过程的分析，确定间歇补料分批发酵的流加工艺为：初始葡萄糖浓度40g/L，当其降至20g/L时开始补加50％葡萄糖，平均每隔6h补糖一次，葡糖糖的流加量控制在能维持发酵液糖浓度在20g/L左右，在整个发酵过程中，葡萄糖总流加量为40g/L。最终纳他霉素的产量提高到5.02g/L，比分批发酵提高了66.78％。 控制pH值的7L自动罐间歇补料分批发酵研究结果显示，流加2mol/L的NaOH，将发酵液pH值控制在5.3～5.4范围内，直到发酵结束，使纳他霉素产量提高到5.32g/L。 采用固液分离甲醇提取法对发酵液中的纳他霉素进行分离提取，确定固相分离工艺为离心速度10000 r/min、离心时间20 min，使固相中纳他霉素浓度达到7.72％，占纳他霉素总量96.18％，实现了发酵液中的固液分离。纳他霉素粗提工艺：用甲醇做提取剂，固液比1：4、混合溶液pH值调到9.5、提取3次。在此提取工艺下得到纳他霉素的纯度为84.13％，回收率87.46％。 大孔树脂浸泡脱色工艺：大孔树脂0.5％、温度40℃、时间30min、pH值6.5。脱色率达12.68％，检测纯度为91.20％，回收率82.12％。 分离提取工艺总回收率为71.87％。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1纳他霉素的发现及命名

1.2纳他霉素的性质

1.2.1物理化学性质

1.2.2活性和稳定性

1.2.3抗微生物性质

1.2.4安全性及毒性

1.3纳他霉素的应用

1.3.1作用特点

1.3.2在食品中的应用

1.3.3在医疗中的应用

1.3.4世界各地法规

1.4纳他霉素的研究概况

1.4.1纳他霉素生产菌种

1.4.2纳他霉素生产菌的代谢途径

1.4.3多烯大环内酯抗生素的生物合成途径

1.4.4纳他霉素发酵生产研究现状

1.4.5纳他霉素分离提取研究现状

1.4.6纳他霉素检测方法研究现状

1.4.7抑菌机理的研究

1.4.8分子生物学研究进展

1.5本论文研究内容

1.5.1确立发酵液中纳他霉素的定量分析方法

1.5.2纳他霉素高产菌株的选育

1.5.3纳他霉素高产菌株摇瓶分批发酵最佳条件研究

1.5.4 7升发酵罐分批发酵

1.5.5纳他霉素的分离提取

第二章发酵液中纳他霉素含量检测方法研究

2.1试验材料

2.1.1菌种

2.1.2试验药品

2.1.3试验仪器

2.1.4培养基基种类及成分

2.2试验方法

2.2.1生物检测法

2.2.2紫外分光光度计法

2.2.3高效液相色谱法

2.3结果与分析

2.3.1二剂量管碟法测定纳他霉素含量方法的确定

2.3.2二剂量管碟法检测发酵液中的纳他霉素含量

2.3.2紫外分光光度计法快速测定纳他霉素产量

2.3.3高效液相色谱法测定纳他霉素产量

2.4小结

2.4.1二剂量管碟法测定纳他霉素含量方法的确定

2.4.2紫外分光光度计法快速测定纳他霉素产量

2.4.3高效液相色谱法测定纳他霉素产量

2.4.4三种测定方法结果的比较

第三章纳他霉素高产菌株的选育

3.1试验材料

3.1.1菌种

3.1.2培养基

3.1.3相关溶液

3.1.4主要药品

3.1.5试验仪器

3.2试验方法

3.2.1斜面培养条件

3.2.2分离平板培养条件

3.2.3种子培养条件

3.2.4发酵培养条件

3.2.5琼脂块法分离提取菌种

3.2.6硫酸二乙酯诱变处理

3.2.7抗性突变株的筛选

3.2.8紫外诱变高产菌株的原生质体制备

3.2.9原生质体紫外线诱变方法的确定

3.2.10指标测定方法

3.3结果与分析

3.3.1琼脂块法初筛出发菌株

3.3.2硫酸二乙酯诱变及菌株抗性的筛选

3.3.3原生质体制备与再生

3.3.4原生质体紫外诱变及菌株抗性的筛选

3.4小结

3.4.1出发菌株筛选

3.4.2硫酸二乙酯诱变及菌株抗性的筛选

3.4.3影响原生质体再生的因素

3.4.4原生质体紫外诱变及菌株抗性的筛选

第四章纳他霉素高产菌株摇瓶发酵条件研究

4.1试验材料

4.1.1菌种

4.1.2试剂

4.1.3试验仪器

4.1.4培养基

4.2试验方法

4.2.1菌种活化

4.2.2斜面培养条件

4.2.3孢子悬浮液的制备与孢子计数

4.2.4种子培养条件

4.2.5发酵培养条件

4.2.6指标测定方法

4.3结果与分析

4.3.1斜面培养基的确定

4.3.2种子培养基的优化

4.3.3种子质量对发酵的影响

4.3.4培养基的优化

4.3.5纳他霉素摇瓶发酵条件的优化

4.4小结

4.4.1培养基优化

4.4.2种子质量

4.4.3碳源与氮源

4.4.4发酵条件

第五章纳他霉素高产菌株7L发酵罐发酵条件研究

5.1试验材料

5.1.1菌种

5.1.2培养基

5.1.3试验药品

5.1.4试验仪器

5.2试验方法

5.2.1 7L自动罐分批发酵参数设定

5.2.2 7L自动罐间歇补料分批发酵

5.2.3控制pH值的7L自动罐间歇补料分批发酵

5.2.4分析方法

5.3结果与分析

5.3.1自动罐分批发酵工艺参数的确定

5.3.2 7L自动罐间歇补料分批发酵试验结果

5.3.3控制pH值的7L自动罐间歇补料分批发酵

5.4小结

5.4.1搅拌转速和空气流量对菌体干重和纳他霉素产量的综合影响

5.4.2 7L自动罐间歇补料分批发酵试验结果

5.4.3控制pH值的7L自动罐间歇补料分批发酵试验结果

第六章纳他霉素分离提取技术研究

6.1试验材料

6.1.1发酵溶液

6.1.2试验药品

6.1.3试验仪器

6.2试验方法

6.2.1提取方法

6.2.2检测方法

6.2.3纳他霉素粗提工艺

6.2.4纳他霉素粗提品的初步提取

6.2.5检测

6.3结果与分析

6.3.1粗提工艺的研究

6.3.2对纳他霉素粗提品的初步提取

6.3.3纳他霉素提取回收率试验结果

6.4小结

6.4.1固体分离工艺

6.4.2纳他霉素粗提工艺

6.4.4大孔树脂浸泡脱色工艺

6.4.5总回收率

第七章讨论

7.1关于纳他霉素检测方法研究

7.1.1管碟法用于抗生素效价(含量)的生物检定的效果

7.1.2紫外分光光度法

7.1.3高效液相色谱法

7.2关于纳他霉素高产菌种选育

7.2.1琼脂块筛选法

7.2.2化学诱变

7.2.3原生质体制备技术

7.2.4抗性筛选方法

7.3关于纳他霉素生产菌种发酵条件

7.3.1培养基的优化

7.3.2环境因素的影响

7.4关于纳他霉素分离提取条件

第八章结论与展望

8.1结论

8.2创新与不足

8.3展望

参考文献

附录

致谢

攻读博士期间发表学术论文