TWEAK诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞合成MMPs及其相关机制的实验研究

摘要

目的:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节组织慢性炎症性病变为主要表现的自身免疫性疾病，其特征性病理改变表现为滑膜组织异常增生，炎性细胞浸润，血管翳形成，最终侵蚀关节软骨和骨，导致关节破坏。其病因及发病机制尚未完全明确。近年研究证实，基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinases，MMPs)在RA关节骨及软骨的破坏中发挥重要作用。肿瘤坏死因子样凋亡的微弱诱导剂(tumor necrosis factor-like weak inducer ofapoptosis，TWEAK)是肿瘤坏死因子(trumor necrosis factor，TNF)配体超家族的新成员，具有广泛的生物学活性。作为一个多效性细胞因子，TWEAK在RA的发生、发展中所起的核心作用备受关注。本研究首先通过观察TWEAK在不同浓度下对RA FLS诱导合成MMPs的影响，探讨TWEAK参与RA关节骨及软骨破坏的相关机制。
　　 TWEAK是通过与其受体相互结合而发挥生物学功能的。TweakR/Fn14是与4种不同的TRAF家族成员相关联的功能性TWEAK受体。研究发现TweakR/Fn14位于质膜，是一种在细胞-基质相互作用中发挥作用的跨膜分子。本实验通过研究TWEAKR/Fn14在RA FLS的表达，以及影响TWEAKR/Fn14在RA FLS表达的因素，进一步探讨TWEAK发挥其生物学功能的具体机制。
　　 TWEAK与RA FLS表面相应的受体结合以后，激活特定的信号转导通路才能发挥其多种生物学效应。p38蛋白激酶是控制炎症反应最主要的MAPK家族成员之一。p38激酶在RA发病中的作用日益受到人们的重视。目前，关于TWEAK处理后的RA FLS能够激活哪些信号转导分子，国内外的研究尚无定论。本实验着重探讨P38MAPK信号通路在TWEAK诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞合成MMPs过程中的作用，试图揭示TWEAK诱导RA FLS活化及导致关节炎性破坏的相关机制，为RA治疗寻求新的靶点。
　　 实验方法:
　　 1、类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的原代培养：在无菌条件下取得新鲜的RA滑膜组织，胶原酶消化法分离纯化滑膜成纤维细胞，实验用3～7代细胞。
　　 2、取处于对数生长期的FLS，调整细胞浓度，接种于6孔细胞培养板，加入TWEAK、TNF-α、IL-1β、SB203580，于37℃5％CO2孵箱内持续培养72h后，收集细胞培养液和细胞置-20℃备用。
　　 3、免疫组化法定位检测TWEAKR/Fn14蛋白在RA FLS的表达。
　　 4、ELISA法检测细胞培养液中MMP-1、MMP-3的浓度。
　　 5、RT-PCR法检测MMP-1、MMP-3、Fn14基因mRNA的表达。
　　 6、、Western blotting法(免疫印迹法)测定TWEAKR/Fn14、p-p38MAPK和p65在RA FLS的表达。
　　 结果:
　　 1、TWEAK诱导RA FLS合成MMP-1、MMP-3的水平高于对照组，呈明显的剂量依赖性，TWEAK终浓度为50 ng/ml的实验组MMP-1、MMP-3刺激指数分别为3.233、3.218，TWEAK终浓度为100 ng/ml的实验组MMP-1、MMP-3刺激指数分别为5.906、6.119，具有显著的统计学差异(P<0.05)；TNF-α和IL-1β对TWEAK诱导RA FLS合成MMP-1、MMP-3具有协同作用，相同TWEAK浓度下的实验组，单纯TWEAK组与协同作用组比较，协同作用组MMP-1、MMP-3的水平明显高于单纯TWEAK组，具有显著的统计学差异(P<0.05)；TNF-α与IL-1β对TWEAK诱导RAFLS合成MMP-1、MMP-3的协同作用，无显著的统计学差异(P>0.05)。
　　 2、TWEAK终浓度为100ng/ml诱导RA FLS的MMP-1、MMP-3mRNA表达水平高于对照组，分别为对照组的1.29、1.26倍，具有显著的统计学差异(P<0.05)；TNF-α和IL-1β对TWEAK诱导RA FLS的MMP-1、MMP-3mRNA表达具有协同作用，单纯TWEAK组与协同作用组比较，协同作用组MMP-1、MMP-3mRNA表达水平明显高于单纯TWEAK组，具有显著的统计学差异(P<0.05)；TNF-α与IL-1β对TWEAK诱导RA FLS MMP-1、MMP-3mRNA表达的协同作用，无显著的统计学差异(P>0.05)。
　　 3、免疫组化染色显示胞膜及胞浆内出现棕黄色颗粒状物质的细胞为TWEAKR/Fn14染色阳性的细胞。结果发现：对照组可见少量TWEAKR/Fn14染色阳性的细胞；TWEAK(终浓度为100ng/ml)存在时TWEAKR/Fn14在RA FLS表达较对照组增多；TNF-α和IL-1β能够显著增强TWEAKR/Fn14在RA FLS的表达。
　　 4、TWEAK终浓度为100ng/ml的实验组与对照组比较，实验组TWEAKR/Fn14蛋白表达为对照组1.199倍，Fn14基因mRNA的表达为对照组的1.273倍；TNF-α和IL-1β对TWEAK诱导RA FLS的TWEAKR/Fn14蛋白表达和Fn14基因mRNA的表达具有协同作用，单纯TWEAK组与协同作用组比较，TNF-α和IL-1β协同作用组TWEAKR/Fn14蛋白表达分别为单纯TWEAK组的2.239、2.359倍，Fn14基因mRNA的表达分别为单纯TWEAK组的1.705、1.738倍。
　　 5、终浓度为100ng/ml的TWEAK作用于RA FLS，能够使p38MAPK磷酸化，并使细胞核内p65蛋白表达增加。p-p38MAPK及p65蛋白表达量随着TWEAK作用时间的延长而增加，TWEAK作用于RA FLS120min时，p-p38MAPK及p65蛋白表达趋于高峰，分别为空白对照组的4.615、3.415倍。
　　 6、SB203580能够部分抑制终浓度为100ng/ml的TWEAK诱导RA FLS合成的MMPs和MMPs mRNA的表达，阳性对照组TWEAK诱导RA FLS合成MMP-1、MMP-3的刺激指数分别为1μmol/L SB203580组的2.106、1.806倍，为10μmol/L SB203580组的3.021、2.417倍，与阳性对照组比具有显著统计学差异(P<0.05)；阳性对照组TWEAK诱导RA FLS表达MMP-1、MMP-3mRNA分别为1μmol/L SB203580组的1.339、1.394倍，为10μmol/L SB203580组的1.419、1.424倍，与阳性对照组比具有显著统计学差异(P<0.05)。
　　 结论:
　　 1、TWEAK通过诱导RA FLS合成MMP-1、MMP-3，直接损伤关节骨和软骨，参与RA的发生发展。
　　 2、TNF-α和IL-1β在TWEAK诱导RA FLS合成MMP-1、MMP-3的过程中，发挥协同作用，从而与TWEAK共同参与RA关节骨和软骨的破坏。
　　 3、RA FLS的质膜存在TWEAKR/Fn14表达，在重组TWEAK存在时TWEAKR/Fn14表达增加。
　　 4、TNF-α和IL-1β通过增加RA FLS的TWEAKR/Fn14表达，发挥对TWEAK生物学活性的协同作用。
　　 5、TWEAK诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞合成MMPs过程中，p38MAPK信号通路处于激活状态，并诱导NF-κB的表达，进而发挥TWEAK的生物学活性。
　　 6、p38MAPK活化的抑制剂SB203580能够显著抑制RA FLS MMP-1、MMP-3mRNA及蛋白质的表达，有望成为RA治疗的有效药物。