实时荧光定量PCR检测NPM1基因突变及表达的方法学构建与临床应用

摘要

目的：急性髓系白血病(AML)是一组在临床及遗传学上均高度异质性的疾病，细胞遗传学和分子遗传学是影响AML患者预后最重要的独立因素。本研究以初诊患者作为研究对象，构建应用实时荧光定量PCR技术定量检测NPM1—A型突变(NPM1—mutA)的方法，检测NPM1—mutA在142例初诊成人AML患者中的发生率，观察其mRNA表达水平与细胞形态学，细胞遗传学，免疫表型等临床特征的关系，探讨其作为监测白血病MRD指标的可行性及其在核型正常AML患者的临床诊断、预后分级等方面的潜在应用价值与意义。 方法：①实时荧光定量PCR检测NPM1—mutA mRNA表达量的方法构建：采用相对定量法，应用TaqMan探针技术，以管家基因ABL为内参，同时设置正常对照和无模板对照；提取待测标本总RNA，测定其核酸浓度，进行10倍系列稀释后作为反应模板，设定其拷贝数为101、102、103、104、105、106构建标准曲线；反应结束后，设定最佳阈值，荧光定量PCR仪给出曲线斜率及Ct值，计算目的基因的相对表达指数，同时对方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。②对142例初诊为AML的成人患者骨髓标本进行FAB细胞形态学分型，常规染色体核型分析及流式细胞术检测其免疫分型。骨髓增生异常综合症(MDS)和继发性AML均不作为入选对象，10名健康捐献者骨髓标本作为对照。③提取AML及健康者骨髓标本总RNA，逆转录为cDNA进行实时荧光定量PCR检测，应用逆转录PCR对定量PCR扩增产物进行确认。定量检测结果参照标准曲线，得到NPM1—mutA mRNA的相对表达指数。④观察并分析NPM1—mutA mRNA的表达水平与AML患者FAB分型、白细胞数量及CD34表达的关系。⑤常规进行方差齐性检验、正态性检验。单变量两组资料之间的比较采用t检验，多组资料之间的比较采用单因素方差分析，方差不齐者采用非参数检验，计数资料使用卡方检验，以P<0.05为差别有统计学意义。采用SPSS12.0统计软件处理分析。 结果：⑴实时荧光定量PCR检测NPM1—mutA的表达量：扩增反应的循环阈值(Cycle threshold，Ct)与起始模板拷贝数的对数存在良好的线性关系(相关系数r=0.9963)，测量范围达1×10-6数量级，且重复性好，管间、批间变异系数(coefficient variation，CV)分别为1.8％、2.1％。⑵142例初诊成人AML患者中NPM1基因第12号外显子的突变检出率为21.8％(31/142)；在M0中占50.0％(1/2)、M1中占25.0％(1/4)、M2中占21.7％(10/46)，M3中占0％(0/44)、M4中占41.7％(10/24)、M5中占47.1％(8/17)、M6中占20.0％(1/5)。⑶64例正常核型AML中NPM1—mutA阳性患者占45.3％(29/64)，78例异常核型AML中检出2例伴有NPM1—mutA(2.6％)。正常核型AML患者NPM1—mutA的比例高于异常核型组(P<0.05)。⑷NPM1—mutA阳性患者具有外周血白细胞高(P<0.05)，CD34表达低的临床特征(P<0.05)。 结论：①成功构建了实时荧光定量PCR检测AML患者NPM—mutA mRNA表达水平的方法。②成人AML尤其是正常核型的AML患者中NPM1基因第12外显子突变发生率高，是目前常见的分子遗传学异常之一。③NPM1—mutA的检出率在AML各FAB分型中存在显著差异，FABM4和M5患者更为多见。NPM1—mutA突变患者具有高白细胞数、CD34表达水平低等临床特征。④NPM基因表达水平有可以做为核型正常的AML监测微小残留病变的指标之一。⑤应用实时荧光定量PCR检测NPM1基因突变的方法简单可靠，易于在临床开展，有助于初诊AML患者的辅助诊断及预后监测。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略语

声明

前言

材料及方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述：核磷酸蛋白突变——新的血液肿瘤分子标记

致谢

个人简介