特应性皮炎与脑源性神经营养因子及丝聚合蛋白的相关性研究

摘要

特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)病因与发病机制尚不清楚，可能是遗传因素、免疫因素、有缺陷的皮肤屏障功能以及环境因素共同作用的结果。神经免疫因素及皮肤屏障功能障碍在AD发病机制中的作用是目前研究的热点。 脑源性神经营养因子(brain—derived neurotrophic factor，BDNF)是神经营养因子(neurotrophins，NTs)家族成员之一，除了具有营养神经作用外，也是炎症反应过程中免疫细胞与神经细胞间的重要调节成分。BDNF在AD发病过程中扮演重要的角色。BDNF血清水平与AD患者的疾病活动性、严重性及生活质量相关。BDNF能够诱导AD患者外周血嗜酸性粒细胞趋化、抑制其凋亡；抑制单个核细胞Th1型细胞因子IFN—γ及IL-12的产生，对Th2型细胞因子IL—4、IL-10和IL-13的产生没有影响，进而导致Th1/Th2型细胞因子平衡紊乱、增加抗原特异性IgE的产生。BDNF基因定位于11号染色体短臂11p13，存在多种基因变异和基因多态性，C270T及G196A多态性的研究倍受关注。最近欧洲有少数BDNF基因C270T及G196A多态性与变应性疾病相关性的研究报道，目前尚无AD与BDNF基因多态性在中国人群中的研究报道。 角质形成细胞不仅是构成体表的屏障，同时也是一种重要的免疫细胞，可分泌多种细胞因子、表达相应细胞因子受体。源自角质形成细胞的细胞因子可以影响炎症细胞的迁移、角质形成细胞本身的增生和分化，也可增强或减弱其它细胞因子的分泌，并辅助T细胞免疫应答，甚至对全身免疫机能也有重要作用。角质形成细胞表达BDNF受体TrkB，并发生TrkB样免疫反应。BDNF已被证实调控角质形成细胞的增殖反应，维持表皮内环境的稳定；但BDNF如何调节角质形成细胞分泌免疫调节型细胞因子、参与皮肤变应性炎症反应尚需进一步研究。 丝聚合蛋白是存在于人表皮角质形成细胞内的一种易溶于水的蛋白，其生成的天然保湿因子(natural moisturizing factor，NMF)对保持皮肤的水合作用及屏障功能至关重要。丝聚合蛋白基因(filaggrin，FLG)位于人类染色体1q21.3区，是表皮分化复合物基因簇的成员之一，与细胞膜形成及表皮终末分化密切相关。FLG基因突变引起的皮肤屏障功能障碍在AD发病中扮演着重要角色，丝聚合蛋白的减少和缺失，可能是引起AD等干燥性皮肤病的主要原因。R501X无义突变与2282del4移码突变是欧洲AD人群FLG基因的主要突变位点；然而，FLG基因突变具有种族及地域差别，在亚洲及非洲AD人群中，并未见R501X及2282del4突变。在日本AD人群中，S2554X无义突变与3321delA移码突变为主要突变位点；但在欧洲AD人群中，未见S2554X与3321delA突变。目前尚无FLG基因突变在中国AD人群的研究报道。 本研究采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction—restriction fragment length polymorphism，PCR—RFLP)结合测序(DNA sequencing)的方法检测BDNF基因C270T、G196A位点多态性以及FLG基因E2422X、Q2417X、S2554X、S2889X、S3296X、R4307X无义突变和7945delA移码突变在中国AD人群的分布，从分子遗传学角度探讨AD的发病机制。同时，我们采用Real-Time RT-PCR及ELISA方法检测BDNF对表皮HaCaT细胞分泌免疫调节型细胞因子IL-10、IL—6、IL-12及IFN—γ的影响，以探讨BDNF介导变应性炎症反应的可能机制及BDNF在AD皮损局部细胞因子网络中可能发挥的作用。 材料和方法： 一、研究对象 1、病例组181例AD患者，符合Williams诊断标准。男性96例，女性85例，平均年龄12.9±13.7岁。入选患者均处于疾病活动期，采用SCORAD评分确定疾病的严重程度。所有患者均为辽宁籍汉族人，彼此间无血缘关系，于就诊前6个月未使用糖皮质激素及免疫抑制剂。 2、正常对照组197例健康志愿者，男性103例，女性94例，平均年龄31.5±9.4岁。已排除有过敏性哮喘、过敏性鼻炎及荨麻疹、湿疹、枯草热等异位性表现者，辽宁籍汉族人，彼此间无血缘关系。 以上两组研究对象均已排除精神、神经系统疾患，体重指数正常范围内，签署知情同意书。 3、HaCaT角质形成细胞株 二、实验材料 EDTA、氯仿、异丙醇、无水乙醇、2×Taq Plus Master—Mix聚合酶、琼脂糖、8％非变性聚丙烯酰胺溶液、限制性内切酶HinfⅠ、Ecol72Ⅰ、NlaⅢ、BfaⅠ、Hpy188Ⅰ、BamHⅠ、DpnⅡ、DdeⅠ、RPMI1640细胞培养液、青链霉素溶液、胰蛋白酶、PBS、DEPC、RealMasterMix。 三、实验方法 1、应用PCR—RFLP方法对BDNF基因C270T、G196A等位基因进行分型。 2、应用Real-Time RT-PCR及ELISA方法检测不同浓度BDNF对HaCaT细胞分泌免疫调节型细胞因子IL-10、IL—6、IL-12及IFN—γ的影响。 3、应用PCR—RFLP结合测序的方法，对FLG基因E2422X、Q2417X、S2554X、S2889X、S3296X、R4307X无义突变及7945delA移码突变进行检测。 四、统计学分析 所有统计学分析过程均采用SPSS13.0软件完成。统计方法主要包括X2检验、单因素方差分析等，P<0.05即具有统计学意义。Hardy—Weinberg平衡吻合性检验、组间基因型频率及等位基因频率的差异性比较采用X2检验，并以优势比(odds ratio，OR)及其95％可信区间(confidende interval，CI)表示相对危险度。 结论： 1、BDNF基因C270T位点多态性与AD的发生有关，携带T等位基因的男性及内源AD患者发病的危险性均明显增加。 2、BDNF基因G196A位点基因型及等位基因在是否伴有一级亲属异位史AD组间分布具有显著性差异，携带A等位基因的伴有一级亲属异位史的AD患者发病的危险性增加。 3、HaCaT细胞经不同浓度BDNF作用后，IL-10mRNA的表达量及培养液上清中IL-10表达水平随BDNF作用浓度的增加呈剂量依赖性升高；IL-12mRNA的表达量及培养液上清中IL-12表达水平随BDNF作用浓度的增加呈剂量依赖性降低。BDNF可能通过调节角质形成细胞分泌不同的免疫调节型细胞因子，改变局部细胞因子环境，在AD患者Th1/Th2型细胞因子平衡紊乱中发挥作用。 4、中国东北地区FLG基因E2422X，Q2417X，S2554X，S2889X，S3296X，R4307X及7945delA位点基因型保守，均为野生型。FLG基因突变存在明显的种族及地域区别。

目录

文摘

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论文说明：英文缩略语

声明

论文一特应性皮炎与脑源性神经营养因子基因C270T及G196A多态性的相关性分析

前言

实验材料和方法

实验结果

讨论

结论

论文二脑源性神经营养因子对角质形成细胞分泌细胞因子影响的研究

前言

实验材料和方法

实验结果

讨论

结论

论文三特应性皮炎与丝聚合蛋白基因突变的相关性研究

前言

实验材料和方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述一脑源性神经营养因子与特应性皮炎的研究进展

综述二丝聚合蛋白与特应性皮炎皮肤屏障功能

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