Pak4负性调节乳腺癌雌激素受体转录活性及其作用机制的研究

摘要

肿瘤是世界范围内人类疾病，其发病率持续上升，严重威胁着人们的身心健康。因此，对于肿瘤的发病机制及诊断治疗研究成为我国目前对肿瘤研究的一个重要课题。寻找肿瘤治疗靶点是当前该领域研究热点。其中对细胞信号转导通路关键蛋白及下游靶蛋白作用分子机制的深入了解能使我们认识恶性肿瘤发生发展的规律所在，在关键作用靶点进行阻遏，达到治疗肿瘤的目的，是近年来人们探寻肿瘤治疗的方向。
　　 P21活化的激酶(P21-activated kinase，Pak)是一类进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，为Rho家族小鸟苷三磷酸酶（Rho-GTPase）Cdc42/Rac、生长因子信号的下游主要靶蛋白，参与许多重要细胞活动。到目前为止Pak家族共有6个成员，皆含有氨基末端（N-末端）调节区和羧基末端（C-末端）激酶区。根据其结构相似性，将它们分为两类，Ⅰ类包括Pak1-3，Ⅱ类包括Pak4-6。两类Pak在结构、活化方式、生物学功能上有着很大的区别，它们具有不同的下游靶蛋白。通过对Pak1下游靶蛋白的研究，我们了解其在肿瘤发生发展中的一些作用。同时，很多学者相继报道了一些与Pak4相互作用的靶蛋白，表明其在肿瘤进展中存在着与Ⅰ类Pak不同的作用方式。因此对Pak4及其相互作用蛋白质的研究也越来越受到关注。
　　 LMO4(LIM domain only4)是短转录调节子，含有两个串联LIM结构域，能够调节蛋白和蛋白之间的相互作用。目前人们发现了4个LMO家族成员，它们是LMO1-4。研究人员报道LMO4与肿瘤发生，细胞凋亡和激素受体调节相关。LMO4蛋白在正常组织形成，器官发育中起到了重要作用，它的异常表达和定位可能与某些疾病发生相关。
　　 本课题主要是在硕士期间进行的酵母双杂交筛选Pak4相互作用蛋白的基础上，从人胎脑cDNA文库中筛选Pak4相互作用蛋白LMO4，以乳腺癌作为研究对象，在体内和体外进一步证实了Pak4与LMO4直接相互作用;同时也证实了Pak4能够与LMO4互作蛋白雌激素受体ERα直接结合，并且能够负性调控雌激素受体的转录活性，为乳腺癌的靶向治疗提供了新的线索。
　　 方法：
　　 1、酵母双杂交筛选Pak4相互作用蛋白质
　　 将Pak4激酶域序列克隆到酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒。质粒转化到酵母感受态AH109和Y187中验证蛋白表达。将人胎脑cDNA文库转化酵母Y187，与已转化诱饵质粒的AH109酵母进行交配实验。交配子在SD/-Leu/-Trp/-His和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-g al平板上筛选，阳性克隆质粒酶切鉴定。
　　 2、Pak4与LMO4在酵母菌中共转验证结合
　　 测序分析得到基因LMO4，将LMO4全长扩增并构建到酵母表达载体pGADT7中，再将Pak4全长构建到酵母表达载体pGBKT7中。将pGADT7-LMO4和pGBKT7-Pak4质粒共转到酵母菌AH109中，进行再次筛选。
　　 3、GST-pull down实验验证Pak4与LMO4在体外能够发生直接结合
　　 分别构建Pak4、LMO4和雌激素受体α(ERα)全长质粒到pCDNA3.1载体，TNT法进行体外转录，并与截短蛋白孵育，确定两者相互结合的区域。
　　 4、细胞内共定位证实Pak4蛋白与ERα蛋白发生相互作用
　　 细胞在4％的多聚甲醛PBS液体中固定15分钟。在经过1％ Trixton-X-10025度透化10分钟。透化后常温一抗孵育2小时，PBS洗三次。二抗孵育偶联分子探针546-Alexa（红色）或488-Alexa（绿色）。DNA染料Topro-3用来染核（蓝色）。Pak4蛋白与ERα蛋白共定位为红色和绿色荧光的混合色黄色。
　　 5、免疫共沉淀实验证实Pak4、LMO4和ERα三者能够在细胞内形成复合体
　　 免疫共沉淀的细胞用冷的PBS清洗三次，细胞中加入含有1％ Triton-X-100，1mM PMSF和protease inhibitor cocktail的IP裂解液，在冰上孵育30分钟进行裂解。将裂解的细胞悬液在4℃离心15分钟。将上清用1ml的不含有Triton-X-100的IP buffer稀释，在每毫克的蛋白样品中加入1微克的抗体4℃进行孵育3小时。免疫沉淀的蛋白质进行10％的SDS-PAGE电泳分离，转印到PVDF膜上，用特异的抗体进行孵育检测。
　　 6、利用Dual-Luciferase Assay System分析Pak4对ERα调控基因上游雌激素受体反应元件（ERE）的转录活性的影响
　　 以ERE-Luc质粒作为报告基因去检测Pak4调控雌激素受体反应元件的能力。重悬MCF-7细胞，计数细胞每个24孔板里有5x104个细胞，用含有3％去激素胎牛血清和无酚红的的RPMI1640培养基进行培养24-48小时。用转染试剂Lipofectamine2000转染0.5μg的ERE-Luc质粒和50ng的TK表达质粒。500ng的Pak4和500ng对照空载体分别进行了转染。细胞在进行转染后加入了雌二醇(E2)和酒精对照，荧光检测按照Dual-LuciferaseTM assay kit说明书在转染24小时内进行操作。萤火虫荧光素酶活性首先进行检测，然后是标准化的海肾荧光素酶活性的检测。在图标中的荧光素酶值是经过了三次独立实验的三次复孔标准化值。标准误在垂直线处显示。
　　 7、染色质免疫沉淀技术(ChIP)
　　 在MCF-7乳腺癌细胞系中进行染色质免疫共沉淀实验。首先，转染pcDNA3.1和pcDNA3.1-Pak4 WT质粒到MCF-7细胞中，用去激素血清和无酚红培养基培养48小时后，雌激素处理30分钟，再用1％的多聚甲醛固定细胞。细胞超声破碎裂解，特异性的Pak4抗体进行染色质免疫共沉淀。以pS2染色质特异引物进行PCR扩增了pS2染色质的特异性区域，用来分析免疫共沉淀的片段中的pS2染色质。特异性的引物为5’-GGGGTACTAAGGGACGACTGC-3’和5’-GCTGGAAACAGGGAAAGAAGG-3'
　　 8、激酶分析实验验证Pak4磷酸化ERα
　　 利用体外纯化的GST-ERα融合蛋白在HEPES缓冲液中进行体外激酶实验。在体系中含有IP进行沉降纯化的活化型myc-Pak4-S445N/S474E(Pak4NE)激酶，10μCi[γ-32P]ATP和25μM冷的ATP。40μl的反应体系在30℃水域中孵育30分钟。
　　 9、免疫组化S-P法检测Pak4和LMO4在乳腺癌样品中的表达
　　 在乳腺癌病例中对Pak4和LMO4的表达进行免疫组化分析，观察肿瘤组织表达和定位。将乳腺癌组织切片放入抗原修复液水域中孵育30分钟进行脱蜡和再水合用。含3％过氧化氢的甲醇对内源性的过氧化物酶活性进行淬灭40分钟，再用普通羊血清对蛋白进行封闭。一抗孵育2小时，再用生物素标记IgG孵育，最后，切片在3，3’-二氨基联苯常温孵育显示褐色沉淀物。
　　 结果：
　　 1、利用酵母双杂交技术筛选了一个新的Pak4相互作用蛋白质LMO4。
　　 2、通过酵母双杂交共转染技术，验证了全长Pak4蛋白与全长LMO4蛋白之间发生相互结合。
　　 3、通过体内co-IP和体内，体外GST-pull down实验证实Pak4能与LMO4相互作用。
　　 4、GST-pull down实验证实Pak4的326-465AA区域能够与LMO4全长发生相互作用。
　　 5、GST-pull down实验证实ERα能够与Pak1、4、5、6发生直接相互作用
　　 6、GST-pull down实验证实ERβ能够与Pak4发生相互作用。
　　 7、GST-pull down实验证实ERα的DBD181-263aa区域能够与Pak4 N末端1-201 aa区域发生相互作用。
　　 8、免疫共沉淀实验证实Pak4能与ERα相互作用。
　　 9、免疫共沉淀实验证实Pak4、LMO4与ERα三者能够形成复合体。
　　 10、免疫荧光结果显示Pak4与ERα在乳腺癌细胞MCF-7中定位于细胞浆中。在E2刺激细胞后，Pak4与ERα蛋白的定位发生了改变，从细胞浆移位到细胞核内，并且在核内发生了共定位。
　　 11、免疫组织化学实验证实在乳腺癌组织中Pak4与ERα可在核内表达。
　　 12、Dual-Luciferase Assay System实验证实Pak4负性调控ERE转录活性，而且Pak4和LMO4协同负性调控ERE转录活性。
　　 13、染色质免疫沉淀技术(ChIP)分析Pak4蛋白作为ERα相互作用蛋白能够共同与靶基因pS2的特异ERE启动子DNA结合。
　　 14、RT-PCR检测在E2刺激下，Pak4下调ERE调控的pS2基因表达。
　　 15、Western Blot检测在E2刺激下，Pak4下调ERαS305位点磷酸化蛋白表达。
　　 16、Dual-Luciferase Assay System实验证实在组蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA)的作用下Pak4对ERE转录活性负性调控出现了逆转。
　　 17、激酶实验证实了Pak4激酶能够磷酸化ERα的AF2区域。
　　 结论：
　　 1、在本研究中，我们证实了雌激素受体α和它的共阻遏物LMO4，作为Pak4新的互做蛋白。LMO4与Pak4 C末端的326-465氨基酸区域特异结合。Pak4在LMO4的参与下与ERα形成复合体。Pak4 N末端包含1-201氨基酸区域与ERα的181-263氨基酸区域相互作用。
　　 2、过渡表达Pak4负性调控了雌激素受体反应元件转录活性。Pak4在乳腺癌肿瘤组织中上调抑制了ERα的转录功能，主要是由于Pak4在乳腺癌演进过程促进了ERα阴性表型转化，导致乳腺癌的侵袭力增强，肿瘤细胞进一步恶化。
　　 3、内源Pak4和ERα在乳腺癌细胞受到雌激素刺激后共定位由细胞浆移动到了细胞核内。ChIP实验也证实了Pak4与ERα在细胞内共同定位于ERα特异调控基因pS2启动子ERE上。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 Pak4与LMO4相互作用的证实

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

论文二 Pak4与雌激素受体相互作用的证实

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

论文三 Pak4在乳腺癌中负性调控ERE转录活性及其负性调控机制的研究

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述

在学期间科研成绩

致谢

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