罗格列酮对颅骨成骨细胞增殖及分化的影响及其作用机制;异黄酮类植物雌激素对ERE和CRE转录活性的调节

摘要

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以骨量低下，骨组织微结构退化，致使骨脆性以及骨折发生风险增加的全身性骨骼疾病，其临床症状主要表现为骨骼疼痛和骨折。骨质疏松是一个世界范围的健康问题，由骨质疏松引发骨折所致的残疾、畸形甚至死亡造成沉重的经济和社会负担，严重危害了人们的健康和生活质量。如何有效预防和治疗OP已成为亟待解决的公共卫生难题。 导致OP发生的原因众多，根据病因可将其分为原发性和继发性两大类。原发性OP主要是随年龄增长发生的一种生理性退行性变，以女性绝经后骨质疏松症为主要代表;继发性OP则多是由其他疾病或药物因素诱发的。其中，近年来在糖尿病治疗中使用的噻唑烷二酮类药物(TZDs)导致的骨质疏松，日益引起人们的关注。尽管OP的病因复杂，究其直接原因都是骨质代谢的失衡导致的。生理状态下，机体的骨质代谢由破骨细胞与成骨细胞共同维持着动态平衡，包括旧骨的吸收和新骨的形成。当成骨细胞的骨形成作用小于破骨细胞的骨吸收作用就会表现为骨量减少，严重的骨量减少即导致OP。而作为骨形成的主要功能细胞，成骨细胞对维持骨代谢平衡和修复骨损伤都具有重要的作用。成骨细胞的增殖分化受到多种信号因子的调节。因此，本课题针对TZDs药物导致的继发性骨质疏松以及绝经后骨质疏松症，分两个部分着重研究了TZDs药物以及大豆异黄酮对成骨细胞功能的影响及其分子机制。 本论文的第一部分主要围绕TZDs所致的继发性骨质疏松。TZDs是针对过氧化物酶体增殖活化受体γ(peroxisome proliferatoractivated receptor gamma，PPARγ)开发合成的特异性配体。而PPARγ是PPARs的一个亚型，属于核受体超家族，是代谢性疾病（如Ⅱ型糖尿病、动脉粥样硬化等）的重要治疗靶标。临床研究显示，长期使用TZDs会增加患者骨折发生的风险。实验室研究发现，PPARγ的表达增加或者内源性PPARγ配体的增多都能显著抑制成骨细胞的功能，增强破细胞的活性，促进骨吸收。这些均提示PPARγ对骨代谢具有调节作用，但具体机制，目前并不清楚。成骨细胞来源于骨髓间充质，部分研究显示，RSG可抑制成骨细胞的早期分化，即骨髓间充质细胞分化为前成骨细胞(pre-osteoblasts)，但对于分化晚期，即前成骨细胞向骨细胞的分化（如颅骨来源的成骨细胞），TZDs是否具有抑制作用，目前也还存在争议。同时，近年来发现，酪氨酸蛋白磷酸酶(Src-homology domain-2 phosphatase1，SHP-1)对破骨细胞具有负向调节作用，可以通过抑制破骨细胞作用而减少骨量丢失，但其对成骨细胞有何作用，是否参与RSG诱导骨质疏松的作用，目前亦未见报道。针对以上问题，我们利用原代培养的小鼠颅骨成骨细胞作为分化晚期的成骨细胞模型，选用罗格列酮（rosiglitazone，RSG）作为TZDs的代表性药物，主要进行了以下两个方面的研究:1.明确RSG对颅骨成骨细胞分化的影响极其机制。2.明确明确RSG对颅骨成骨细胞增殖的影响及其机制; 本论文的第二个部分在成骨样细胞MG-63上进行。雌激素对于绝经后骨质疏松的治疗，效果显著。但同时又存在易诱发乳腺癌、子宫内膜癌等潜在危险因素。近年来，植物雌激素作为一种天然的选择性雌激素受体调节剂(SERM)，在骨质疏松的防治中日益受到关注。大豆异黄酮是其中最具代表性的一类。大豆异黄酮(soybeanisoflavone)，属植物黄酮类，主要来源于豆科蝶形花亚科植物，是一类具有广泛营养学价值，健康保护和治疗学意义的非固醇类物质。大豆异黄酮的结构与雌激素相似，能够与雌激素受体(ERs)结合，进而发挥转录调节的作用。ER分为仅和β两种亚型，雌激素与ER结合后，除了通过经典的ERE途径调节基因转录外;也有大量的文献报道，雌激素还可以通过蛋白-蛋白间的相互作用，调节CRE介导的基因转录。异黄酮类植物雌激素是否也能像雌激素一样，对ERE和CRE介导的基因转录都具有调节作用呢？有关这方面的报道，结论不一。因此，我们在MG63细胞上，主要进行了两方面的研究:1.比较大豆异黄酮与雌激素在雌激素经典作用途径中的作用异同，即两者对ERE报告基因的转录调节作用有何差别;2.比较大豆异黄酮与雌激素在雌激素非经典作用途径中的作用异同，即两者对CRE报告基因的转录调节作用有何差别。 主要实验结果如下: 一、罗格列酮对颅骨成骨细胞增殖及分化的调节作用 （一） RSG抑制颅骨成骨细胞分化的作用及其机制 1、在原代培养的小鼠颅骨细胞上，利用β-磷酸甘油和L-抗坏血酸共同诱导其成骨细胞的成熟，给予不同浓度的RSG（10-9～10-6M）连续处理10天。RSG能剂量依赖性的抑制碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、1型胶原蛋白(type1 collagen，Col1)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor2，Runx2)、骨钙素(osteocalcin，OC)等成骨相关基因的mRNA表达。 2、在诱导条件培养基培养，并给予不同浓度的RSG（10-9～10-6M）连续处理21天，利用茜素红染色以及碱性磷酸酶活性检测，观察RSG对骨钙结节形成的影响。结果显示，RSG能显著抑制钙结节的形成，抑制碱性磷酸酶的活性，其抑制效应呈现剂量依赖性。 3、Wnt/β-catenin通路已知在促进成骨细胞分化成熟过程中发挥主要作用。作为调节Wnt信号通道中最关键的事件之一，β-catenin在胞内的水平可受到GSK-3β的调节。当GSK3β被激活能促进β-catenin的降解，降低其在胞内的表达水平，从而抑制骨形成。为明确RSG抑制成骨细胞的分化是否是通过激活GSK3β实现的。我们选取GSK3β的特异性阻断剂SB216763（2*10-5M）与RSG（10-6M）共同处理成骨细胞。SB216763能完全逆转RSG抑制Col1，ALP，Runx2，OC等成骨相关基因的mRNA表达。 4、用SB216763（2*10-5M）与RSG（10-6M）共同处理成骨细胞21天，SB216763能完全逆转RSG对制钙结节形成以及碱性磷酸酶活性的抑制作用。以上结果提示，RSG抑制成骨细胞的分化是通过激活GSK3β实现的。 5、为进一步探讨RSG作用的受体机制，我们联合使用PPARγ特异性阻断剂GW9662(10-6M)与RSG(10-6M)，分别观察成骨相关基因，骨钙形成以及碱性磷酸酶活性的变化，以明确RSG抑制成骨细胞的分化是否通过PPARγ。结果显示，GW9662只能部分逆转RSG对上述观察项目的抑制效应。进一步利用siRNA干扰技术，敲低细胞内的PPARγ，所得结果与使用GW9662的作用一致。以上结果提示RSG激活GSK3β的作用仅部分通过PPARγ实现。 6、有文献报道，RSG在骨细胞上可以不依赖于PPARγ，而是通过膜受体GPR40发挥作用。为明确在成骨细胞上，RSG是否也存在同样的作用机制，我们使用GPR40的激动剂GW9508(10-5M)单独处理细胞，未观察到其对成骨基因mRNA表达的影响。接着，又利用siRNA技术敲低细胞内的GPR40，再用RSG(10-6M)处理，分别观察成骨基因的表达，骨钙形成以及碱性磷酸酶活性等指标。结果显示，敲低GPR40后，也只能部分逆转RSG对上述指标的抑制作用。同时，我们还观察了RSG对PPARγ以及GPR40蛋白表达的影响。结果显示，在不给诱导条件时，细胞内PPARγ处于极低的水平，而GPR40水平较高。给予诱导条件后，PPARγ表达增多，而GPR40的表达显著降低。在RSG处理后，PPARγ和GPR40都剂量依赖的表达增多。提示GPR40在成骨诱导过程中维持低表达，RSG可促进GPR40表达，后者由此介导了部分RSG作用。 7、我们还观察了诱导成骨细胞成熟过程中，SHP-1的mRNA和蛋白表达的变化。发现随诱导时程的延长，SHP-1 mRNA和蛋白表达呈现时间依赖性增加。给予不同浓度的SHP-1的特异性拮抗剂NSC87877处理。NSC87877对上述成骨基因mRNA的表达以及β-catenin的蛋白表达均有显著的抑制作用，并呈剂量依赖性。进一步，利用siRNA技术敲低细胞内的SHP-1或是过表达无催化活性的SHP-1突变质粒，均能显著抑制成骨基因的表达。提示SHP-1具有促进成骨细胞成熟的作用。 8、给予GSK3β特异性阻断剂SB216763与NSC87877共同作用，SB216763能逆转NSC87877抑制β-catenin蛋白表达的作用，提示，SHP-1促进成骨的作用是通过抑制GSK3β的激活实现的。 9、给予RSG处理，成骨细胞中SHP-1的mRNA表达显著下降，提示RSG抑制成骨细胞中SHP-1的mRNA表达。 （二） RSG抑制颅骨成骨细胞增殖的作用及其机制 1.在原代培养的小鼠颅骨细胞上，利用β-磷酸甘油和L-抗坏血酸共同诱导其成骨细胞的成熟，给予不同浓度的RSG(10-9～10-6M)连续处理5天。利用MTT法，观察到，RSG剂量依赖性的抑制成骨细胞的增殖。 2.给予GSK3β的特异性阻断剂SB216763(2*10-5M)与RSG(10-6M)共同处理成骨细胞。SB216763能完全逆转RSG对成骨细胞增殖的抑制效应。提示，RSG抑制成骨细胞的增殖也是通过激活GSK3β实现的。 3.进一步探讨RSG抑制增殖作用的受体机制，联合使用PPARγ特异性阻断剂GW9662(10-6M)与RSG(10-6M)，结果GW9662不能阻断RSG抑制成骨细胞增殖的作用。进一步利用siRNA干扰技术，敲低细胞内的PPARγ，RSG抑制增殖的效应仍然存在，提示RSG抑制成骨细胞增殖的作用不依赖于PPARγ。 4.为明确RSG是否通过GPR40来抑制成骨细胞的增殖，我们利用siRNA技术，敲低细胞内GPR40，再用RSG处理细胞，结果发现，RSG抑制成骨细胞增值的作用被完全逆转了。这提示，RSG是通过GPR40发挥抑制成骨细胞增殖的效应。 5.我们也观察了SHP-1在成骨细胞增殖中的作用。利用siRNA技术敲低细胞内的SHP-1，成骨细胞的增殖显著降低。提示SHP-1对成骨细胞的增殖具有正向调节作用。 二、异黄酮类植物雌激素对ERE和CRE转录活性的调节 （一）异黄酮类植物雌激素对ERE转录活性的调节 1、利用脂质体瞬时转染的方法，在MG63细胞上分别过表达ERα和ERβ，给与不同浓度的雌激素和植物雌激素（大豆甙元、染料木素、葛根素、山萘酚、槲皮素）处理，结果发现，在过表达ERα时，E2在10-10～10-8M，都能显著促进ERE报告基因的转录;大豆甙元和染料木素在高浓度(10-6M，10-7M)对ERE报告基因的转录有较强的促进作用;其他植物雌激素，除山萘酚在高浓度时（10-6M）有微弱的促进作用外，对报告基因的转录均没有调节作用。 过表达ERβ后，除山萘酚和槲皮素的作用与过表达ERα的结果相同外，雌激素和其余的植物雌激素均对报告基因的转录有调节作用。E2从10-9～10-6M，都能显著促进ERE报告基因的转录;大豆甙元以及染料木素对ERE报告基因的转录促进作用均较过表达ERα时的效应显著。而葛根素（10-10～10-6M）对报告基因的转录呈现出非浓度依赖的抑制作用。 2、进一步观察雌激素受体完全拮抗剂ICI182，780以及选择性雌激素受体拮抗剂4-OH-tamoxifen通过不同的ER亚型对ERE报告基因的转录调节作用。将ERα或ERβ与ERE报告基因共转染后，给与ICI182，780或4-OH-tamoxifen处理。ICI182，780仅在过表达ERβ时，对报告基因表现出剂量依赖性的转录

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 罗格列酮对颅骨成骨细胞增殖及分化的影响及其作用机制

前言

材料与方法

实验结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 异黄酮类植物雌激素对ERE和CRE转录活性的调节

前言

材料与方法

实验结果

讨论

小结

参考文献

综述：Wnt和PPARγ信号通路在骨形成和脂肪形成中的作用

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