雌激素诱导的子宫内膜癌细胞中AT1-R与MAPK信号转导途径的相关性研究

摘要

目的：
　　 子宫内膜癌目前已经成为发病率最高的女性恶性盆腔生殖道肿瘤，约占女性癌症的7％，严重威胁女性的健康。子宫内膜癌的发病机制十分复杂，高水平雌激素长期刺激与子宫内膜癌发病关系密切，AT1R在许多肿瘤细胞中过表达，为此我们探讨雌激素能否通过AT1R受体激活子宫内膜癌MAPK信号转到途径。
　　 本实验采用免疫荧光观察AT1R在子宫内膜细胞中的表达，用MTT方法测定雌激素诱导及AT1R受体抑制剂干预的子宫内膜癌细胞增殖的影响，流式细胞仪碘化丙啶(PI)染色分析细胞周期分布，采用Annexin Ⅴ-FITC试剂盒检测AT1R受体抑制剂对雌激素诱导的ishikawa细胞凋亡的影响，应用siRNA技术处理子宫内膜癌细胞后在用MTT、流式细胞技术、Westernblot分别检测细胞的增殖、周期和凋亡、ERK1/2的表达。探讨其在子宫内膜癌发生中的意义，为子宫内膜癌的治疗提供新的理论依据。
　　 材料和方法
　　 1、材料
　　 (1)细胞系 人子宫内膜癌ishikawa，细胞系来源日本大学妇产科实验室馈赠，经检测雌激素受体和孕激素受体表达均阳性。
　　 (2)试剂 水溶性17β-雌激素、saralasin、四甲基亚唑蓝(MTT)和碘化丙啶(PI)购自美国sigma公司，Annexin Ⅴ-FITC试剂盒购于晶美生物公司。AT1-RsiRNAs由上海吉凯基因化学技术有限公司合成并进行荧光标记。
　　 2、实验方法
　　 应用MTT方法检测出雌激素最佳诱导浓度及AT1R受体抑制剂saralasin的最大抑制浓度，然后对各实验组利用MTT检测细胞增殖，流式细胞技术检测细胞凋亡及周期；利用siRNA-AT1R干扰后的ishikawa细胞同理检测上述指标及ERK1/2的表达。
　　 3、统计学分析
　　 实验数据以MEAN±SD表示，采用SPSS13.0统计软件进行方差分析，P<0.05表示有显著性差异。
　　 结果：
　　 1、免疫荧光实验证实AT1R表达于ishikawa细胞膜和细胞质中。
　　 2、雌激素浓度在10-8mol/L对细胞促增殖最明显，saralasin在10-5mol/L对ishikawa细胞抑制最明显，用上述浓度作用于ishikawa细胞，在10min组对细胞抑制最明显，p<0.05。因此我们后续实验采用10min，来研究细胞周期和凋亡。
　　 3、细胞周期 雌激素组G0/G1期减少，S期增多；saralasin组G0/G1期增多，S期减少。
　　 4、细胞凋亡 正常对照组细胞早期凋亡率为9.54％，雌激素组细胞早期凋亡率6.87％，saralasin组细胞早期凋亡率为13.19％，各组间差异有统计学意义(P<0.01)；晚期凋亡率和坏死率正常对照组为4.13％，雌激素组为4.79％，saralasin组为8.54％，各组间差异有统计学意义(P<0.05)。
　　 5、荧光标记的siRNA(GFP-siRNA)转染结果 通过转染后细胞在荧光显微镜观察荧光强度筛选出一条转染率较高的一条链，利用这条转染后测AT1-R蛋白条带在24h、48h和72h的抑制率分别为32.82％、52.47％和82.40％，在下一步实验中我们采用72h加入处理因素。
　　 6、AT1-R siRNA对雌激素诱导的ishikawa细胞增殖的影响siRNA-AT1R组为87.23％，Estrogen组为89.55％，从相对siRNA-AT1R组增殖率表明转染后细胞增殖低于对照组，雌激素诱导10min其增殖不明显。
　　 7、流式细胞检测周期及凋亡ishikawa细胞自然凋亡率为1.73％，转染AT1-RsiRNA-372h后，凋亡率为14.39％，转染AT1-R siRNA-372h后再经10-8mol/l雌激素处理10min后，凋亡率为13.45％。siRNA作用后G0/G1期细胞与对照组比比例升高，S其比例减少，G2/M期变化不大；雌激素组和转染组比，G1/G0期增多，S期减少，G2/M期变化不大。
　　 8、Western blot正常ishikawa细胞、转染siRNA-AT1R及转染siRNA-AT1R的ishikawa细胞雌激素处理后的细胞，western blot检测ERK1/2蛋白表达变化，其中转染siRNA-AT1R组ERK1/2表达明显下降。
　　 结论：
　　 1、雌激素在两小时内其刺激ishikawa增殖作用以30min中最强，使细胞G1期下降，S期升高；
　　 2、saralasin对雌激素诱导的ishikawa细胞增殖有比较明显的抑制作用，从相对抑制率看，在10min时有相对明显的抑制作用；saralasin能使晚期凋亡增加及早期凋亡增加。
　　 3、利用siRNA技术沉默ishikawa中AT1R，再用雌激素进行诱导，进一步证实了在有效抑制AT1-R基因表达的ishikawa细胞增殖受到明显抑制，转染AT1-R siRNA后的ishikawa细胞凋亡被明显促进，雌激素诱导转染后细胞可促进细胞增殖；细胞周期分析表明转染后ishikawa细胞的G0/G1期增高，S期降低，G2/M期变化不明显。
　　 4、沉默ishikawa中AT1R后其ERK1/2表达下降，说明在ishikawa细胞系中可能AT1-R是通过MAPK信号途径来调节增殖和凋亡。

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