慢性阻塞性肺疾病呼吸道粘液纤毛清除功能与细菌感染相关性的研究

摘要

目的:
　　 慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种慢性进展恶化的炎症性疾病,由多因素致病。COPD的反复急性加重将会导致肺功能进一步减退,加重气道炎症并增加病死率。感染和非感染因素都会引起COPD急性加重,其中气道粘液高分泌和细菌感染是COPD加重的常见原因。近期研究结果显示吸烟小鼠对铜绿假单胞菌的清除减低,延迟清除伴随临床表现恶化和气道炎症增加。但该实验发现吸烟不影响巨噬细胞的吞噬活性,表明有不依赖于吞噬机制导致的铜绿假单胞菌清除延迟。吸烟也降低支气管肺泡灌洗液中的SPA。缺乏SPA小鼠较野生型小鼠铜绿假单胞菌感染后具有更多的细菌负荷,同时伴有增加的TNF-α。
　　 COPD宿主固有防御受损,最重要的是粘液纤毛清除功能(Mucociliaryclearance,MCC)功能减低。MCC在COPD发病中的作用日益引起人们的重视。MCC主要是由纤毛和粘液组成,它是呼吸系统的重要防御机制之一,它主要通过纤毛摆动对粘液的清除,从而把吸附在粘液中的细菌等微生物排出体外。COPD时,MCC异常,导致粘液潴留,气流受限及细菌感染,可以引起COPD急性加重。但目前缺乏合适的动物模型能同时观察COPD肺的清除功能及呼吸道MCC功能。
　　 标准桃金娘油是一种从植物中提取的脂溶性挥发油,其主要成分是桉油素、柠檬烯和α-蒎烯。它能增强黏液纤毛清除功能,并有一定的抗炎作用。国外临床研究表明标准桃金娘油可以防止COPD患者气道阻塞,减少急性发作次数。但其作用机制尚不清楚。粘液高分泌是气道阻塞的重要原因,而细菌感染是COPD急性加重的主要诱因。由此,我们设想标准桃金娘油是否通过减少气道粘液分泌、改善MCC功能来促进下呼吸道细菌的清除,从而减轻气道阻塞、减少肺内细菌定植。
　　 吸烟被认为是COPD发病的最主要危险因素。有研究表明吸烟损伤纤毛结构及功能、导致粘液高分泌,影响粘液纤毛清除功能,感染病原体不能被有效清除,从而放大免疫炎症反应,促进中性粒细胞释放弹性蛋白酶,氧化剂及金属蛋白酶等引起组织破坏及增加粘蛋白分泌,促进COPD的发生和发展。吸烟可刺激单核巨噬细胞和T细胞等炎症细胞产生前炎症因子、趋化因子及细胞因子,如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等。炎性介质在启动和维持粘蛋白高分泌中起重要作用。已经证实TNF-α导致气道粘蛋白表达增加。NF-κB是转录调节因子家族的组成部分,调节炎症免疫反应基因的表达。在吸烟导致粘蛋白高分泌中,NF-κB是重要的信号通路。
　　 本实验我们采用被动吸烟的方法建立COPD大鼠模型来研究吸烟对粘液纤毛传输系统的影响;观察COPD大鼠PA感染后细菌清除和免疫炎症反应过程;同时给予标准桃金娘油进行干预,观察标准桃金娘油在下呼吸道细菌清除、气道炎症及黏蛋白高分泌中的作用;并进一步探讨标准桃金娘油参与气道细菌清除及粘液高分泌的分子机制,为COPD的防治提供了一个新的视角。
　　 方法:
　　 1、Wistar大鼠随机分组,采用被动吸烟12周的方法建立COPD大鼠模型。对照组不做任何干预。标准桃金娘油组于每日吸烟前给予标准桃金娘油灌胃治疗至第12周末。
　　 2、用HE染色评估肺部病理改变及形态学测量。
　　 3、小动物肺功能仪测定大鼠肺功能。
　　 4、扫描电镜观察大鼠气道纤毛形态学。
　　 5、99mTc-SC气溶胶显像测定气道MCC功能。
　　 6、制备大鼠铜绿假单胞菌肺部感染模型。
　　 7、行支气管肺泡灌洗计数白细胞及菌落数。
　　 8、用ELISA法测定肺部TNF-α、IL-6的含量。
　　 9、采用AB-PAS染色方法了解气道杯状细胞增生情况。
　　 10、用免疫组化法测定气道上皮Muc5ac的表达。
　　 11、采用荧光定量RT-PCR方法检测气道Muc5ac mRNA的表达。
　　 12、采用Western blot方法检测肺部信号蛋白NF-κB的表达水平。
　　 结果:
　　 1、吸烟导致COPD大鼠模型。
　　 吸烟12周大鼠出现明显气道炎症和肺气肿的病理改变:FEV0.3/FVC、PEF显著降低。
　　 2、扫描电镜观察到COPD组大鼠气道上皮破坏,纤毛细胞数量显著减少,有的上皮完全脱落。
　　 3、99mTc-SC气溶胶显像测定气道MCC功能,结果显示COPD组的气道粘液纤毛清除率较对照组明显下降(P＜0.05)。
　　 4、与对照组相比,COPD大鼠铜绿假单胞菌清除减低(P＜0.05),标准桃金娘油组大鼠肺组织匀浆及支气管肺泡灌洗液中活菌计数明显降低(P＜0.05)。
　　 5、COPD大鼠肺内细胞总数、中性粒细胞以及前炎症细胞因子TNF-α、IL-6的表达增加,标准桃金娘油减少吸烟引起的炎症细胞及炎症因子TNF-α、IL-6的释放。
　　 6、AB-PAS染色结果示COPD组大鼠气道上皮杯状细胞明显增加,标准桃金娘油能抑制吸烟引起的杯状细胞增生(P＜0.05)。
　　 7、荧光定量RT-PCR和免疫组化检测结果显示吸烟从基因和蛋白水平增加粘蛋白Muc5ac表达,标准桃金娘油明显抑制吸烟引起气道粘蛋白Muc5ac的表达(P＜0.05)。
　　 8、铜绿假单胞菌感染引起Muc5ac粘蛋白表达增加在24h时达高峰,72h后有所降低。
　　 9、COPD大鼠模型中肺组织NF-κB水平明显增高,标准桃金娘油抑制吸烟导致的NF-κB表达增加。
　　 10、标准桃金娘油组大鼠肺部细菌计数减少与粘蛋白Muc5ac、NF-κB的表达下降及炎症因子TNF-α、IL-6的释放减少呈正相关。
　　 结论:
　　 COPD大鼠较对照组大鼠对铜绿假单胞菌的清除能力明显减低,这种清除缺陷同时伴有气道上皮MCC减低。COPD大鼠细菌定植放大和延长免疫炎症反应,同时促进粘蛋白表达。标准桃金娘油促进铜绿假单胞菌从肺内清除。它能抑制吸烟导致的粘蛋白Muc5ac高分泌;同时亦能抑制由吸烟引起的炎症因子释放及NF-κB表达。标准桃金娘油增加细菌清除与它能抑制气道炎症、减少粘蛋白分泌部分相关。