5-Aza-CdR对Hs888T骨肉瘤细胞增殖、凋亡及APAF-1基因表达的影响

摘要

目的：
　　 骨肉瘤是一种常见的恶性骨肿瘤,好发于青少年,恶性程度高,进展迅速,然而骨肉瘤的发病机制尚未清楚。表观遗传学中DNA甲基化介导的基因沉默是肿瘤中常见的基因变异。APAF-1基因位于染色体12q23,是在线粒体凋亡途径中p53下游的关键成分,是凋亡的核心。在多种肿瘤和细胞系中发现了APAF-1基因甲基化。我们前期实验用COBRA方法检测证实Hs888T细胞系中APAF-1基因存在甲基化。本实验拟检测DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理前后骨肉瘤细胞Hs888T的细胞增殖、周期及Apaf-1蛋白表达水平变化,探讨5-Aza-CdR在骨肉瘤发生、发展的作用及机制。
　　 方 法
　　 1、主要试剂
　　 骨肉瘤细胞系Hs888T。购自上海细胞库,5-Aza-CdR购自Sigma公司,DMEM培养基购自Hyclone公司,羊抗人 APAF-1多克隆抗体及兔抗羊二抗购自SantaCruz公司。
　　 2、细胞培养及药物处理
　　 人骨肉瘤细胞系Hs888T接种于DMEM培养液于37℃,含5％CO2的湿润的空气培养箱中。培养24小时候后用不同浓度的5-Aza-CdR(0、0.1 and 0.3mmol/L)处理48h、96h后收集细胞进行实验。
　　 3、四唑盐(MTT)比色法检测Hs888T增殖活性
　　 取对数生长期的细胞,按1 x103/100μl细胞接种于96孔板中,每孔加入细胞悬液200μL。实验组和对照组分别设6个复孔。分别培养44h、92h后倾去培养基,各孔加入5g/L,的MTT 20μL继续培养4h。选择570nm波长,在酶标仪上测定各孔光吸收值(A)。
　　 4、流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡水平
　　 收集处理的各组细胞,70％冰乙醇4℃固定过夜,RNaseA 37℃孵育30min后,加入0.05g/L碘化丙啶(PI)1ml,4℃避光染色30min后上机检测,测定细胞周期及细胞凋亡率。
　　 5、Western blot法检测细胞Apaf-1蛋白表达水平
　　 提取总蛋白,用考马斯亮兰法定量。将等量的总蛋白(100μg)进行SDS-PAGE电泳后转移到PVDF上,用5％脱脂奶粉液室温下封闭2h。加一抗4℃过夜,TTBS液洗膜两次后加入二抗37℃孵育1h。膜经ECL发光试剂处理后检测蛋白表达情况。
　　 6、统计分析
　　 资料比较采用t检验,利用SPSS for Window 16.0进行统计分析。P<0.05有统计学意义。
　　 结 果
　　 本实验用5-Aza-CdR处理Hs888T细胞后,MTT检测发现5-Aza-CdR使Hs888T细胞增殖受到不同程度抑制,通过流式细胞术碘化丙啶PI单染结果我们可以看出5-Aza-CdR阻滞Hs888T细胞在G0/G1期并诱导细胞凋亡且呈时间和浓度依赖性。Western blot结果示Hs888T细胞系经5-Aza-CdR处理后随着药物浓度的增加APAF-1蛋白的表达逐渐增强,APAF-1蛋白表达的变化可能是参与5-Aza-CdR抑制Hs888T细胞增值的机制之一。
　　 结 论
　　 去甲基化试剂5-Aza-CdR能抑制Hs888T细胞生长,阻滞Hs888T细胞于G0/G1期,促进Hs888T细胞分化和诱导其凋亡,并能上调APAF-1基因蛋白的表达,其作用机制可能是5-Aza-CdR使APAF-1等抑癌基因去甲基化而重新激活表达,从而达到抑制肿瘤生长。

目录

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结果

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结论

本研究创新性自我评价

参考文献

综述

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