CRM197和顺铂联合应用对胶质瘤U251细胞的作用及其机制初探

摘要

脑胶质瘤是最为常见的中枢神经系统原发肿瘤,据统计我困脑胶质瘤占颅内肿瘤的35.2％-61.0％,平均49.7％。化学治疗作为胶质瘤治疗的重要补充,其地位已经明确并得到肯定。
　　 交叉反应物质197(cross-reacting materia1197,CRM197)是白喉毒素突变体中的一种,丧失毒性的同时仍保留白喉毒素的免疫原性,它们均可以与细胞膜上的白喉毒素受体(diphtheria toxin receptor,DTR),也称肝素结合表皮生长因子的膜结合前体(pro heparin-binding epidermal growth factor,pro HB-EGF)结合。本实验室前期研究证实DTR在人脑胶质瘤中表达,且其表达水平与胶质瘤病理级别呈显著正相关关系。从20世纪80年代中期起,CRM197就作为载体蛋白应用于人类疫苗的接种。最近研究发现,CRM197能够作为转运载体,转运大分子的辣根过氧化物酶通过血脑屏障(blood brain barrier,BBB),目前认为其机制主要是CRM197与DTR结合后,通过受体介导的胞吞转运通过BBB。研究证实,CRM197具有抗肿瘤作用,但CRM197对胶质瘤的作用尚未见报道,其与传统化疗药物联合应用可能成为胶质瘤治疗的新途径。
　　 P13K/Akt信号通路在肿瘤的增殖、凋亡、血管发生以及细胞运动中发挥着重要作用。P13K/Akt信号通路被激活,抵抗细胞凋亡,促进肿瘤生长。顺铂是治疗胶质瘤的常用化疗药物,但易产生耐药性,限制了其在临床上的应用。实验研究证明,顺铂作用于肿瘤细胞,可以激活P13K/Akt信号通路,抑制细胞凋亡,而CRM197可以抑制P13K/Akt信号通路的激活。CRM197和顺铂联合应用,CRM197是否可以通过抑制顺铂引起的P13K/Akt信号通路的激活,提高胶质瘤对顺铂的敏感性而提高化疗效果,为治疗脑胶质瘤提供新途径足本实验的研究宗旨。
　　 材料和方法：
　　 一、实验材料
　　 (一)实验细胞株U251胶质瘤细胞株由中国医科大学细胞生物重点实验室提供。
　　 (二)主要试剂CRM197,顺铂,MTT,DMSO,LY294002,Wortmannin(美国Sigma公司),DMEM/F-12培养基(美国HyClone公司);胎牛血清(天津灏洋生物科技有限公司);AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒,细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒(南京凯基生物科技有限公司);羊抗Aktl/2多克隆抗体,兔抗p-Aktl/2/3(Ser473)多克隆抗体,小鼠抗β-actin单克隆抗体,增强化学发光法试剂盒(美国Santa Cruz公司);兔抗山羊HRP标记的IgG二抗,山羊抗兔HRP标记的IgG二抗,山羊抗小鼠HRP标记的IgG二抗(北京中山生物技术公司)。
　　 (三)主要仪器细胞培养箱(美国Forma scientific公司);超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);倒置显微镜(同本TMS公司);紫外一可见光分光光度计(日本岛津公司);BDFACSCalibur流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司);超声粉碎机(德国Dr.Hielscher公司);台式低温超速离心机(德国Sigma公司);聚丙烯酰胺凝胶电泳装置(美国Bio-Rad公司);转印仪(北京市六一仪器厂);Las3000成像系统(日本FUJIFILM公司);凝胶成像分析软件(江苏捷达科技有限公司);电子分析天平(德国Sartofius公司);-80℃超低温冰箱(日本SANYO公司);恒温震荡水浴(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司);旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)。
　　 二、实验方法：
　　 (一)细胞培养
　　 (二)药物浓度设计及分组1、(1)对照组(2)顺铂(51ug/m1)组(3)CRM197(1ug/m1)组(4)顺铂(51ug/m1)+CRM197(1ug/m1)组
　　 2、(1)对照组(2)LY294002(10um/1)组(3)Wortmannin(1um/1)组(4)顺铂(5ug/m1)+CRM197(1ug/m1)组(5)顺铂(5ugm1)+CRM197(1um/ml)+LY294002(1Oum/1)组(6)顺铂(51ug/m1)+CRM197(1ug/m1)+Wortmannin(1um/1)组
　　 (三)细胞生长抑制实验(MTT比色法)
　　 (四)细胞凋亡Annexin V-FITC/PI检测
　　 (五)细胞凋亡线粒体膜电位检测(JC-1)
　　 (六)Western blot方法检测Akt及p-Akt蛋白的变化
　　 (七)统计学处理所有数值以均数士标准差(X±SD)表示,采用SPSS13.0统计软件对实验数据进行分析,组问比较采用单因素方差分析(Bonferroni检验),P　　 实验结果：
　　 一、MTT方法检测药物作用不同时间后对U251细胞生长的影响顺铂,CRM197,顺铂+CRM197作用U251细胞0h,3h,6h,12h,24h,48h后,应用MTT方法检测各组药物对U251细胞生长的影响。顺铂,顺铂+CRM197以时间依赖方式抑制细胞生长;CRM197对细胞生长的抑制作用在24h达到峰值,之后下降。与同时间点顺铂或CRM197组相比,顺铂+CRM197显著抑制细胞生长,但顺铂+CRM197作用48h与同时间点顺铂组相比则没有显著差异。因此,在后续试验中选择24h作为最长给药时间。
　　 二、Annexin V-FITC/PI染色方法检测药物作用24h后对U251细胞凋亡的影响
　　 顺铂,CRM197,顺铂+CRM197作用U251细胞24h后,应用Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡。对照组,顺铂组,CRM197组,顺铂+CRM197组的凋亡率(含坏死细胞)分别是4.73±2.13％,34.61±4.23％,18.88±3.66％,43.62±3.03％。与对照组相比,顺铂,CRM197,顺铂+CRM197显著诱导细胞凋亡;与顺铂或CRM197组相比,顺铂+CRM197显著诱导细胞凋亡。
　　 三、线粒体膜电位JC-1染色方法检测药物作用24h后对U251细胞凋亡的影响
　　 顺铂,CRM197,顺铂+CRM197作用U251细胞24h后,应用线粒体膜电位Jc-1染色方法检测细胞凋亡。对照组,顺铂组,CRM197组,顺铂+CRM197组的凋亡率分别是6.83±1.91％,38.22±3.82％,20.78±3.22％,44.03±3.63％。与对照组相比,顺铂,CRM197,顺铂+CRM197显著诱导细胞凋亡;与顺铂或CRM197组相比,顺铂+CRM197显著诱导细胞凋亡。
　　 四、Western blot方法检测药物对U251细胞P-Akt及Akt蛋白表达水平的影响
　　 顺铂,CRM197,顺铂+CRM4197作用U251细胞Oh,3h,6h,12h,24h后,应用Westernblot方法检测p-Akt及Akt蛋白的表达。顺铂上调p-Akt蛋白的表达;CRM197下调p-Akt蛋白的表达;顺铂+CRM197下调P-Akt蛋白的表达,12h达到最低值,持续至24h。顺铂,CRM197,顺铂+CRM197作用U251细胞24h后,应用Westernblot方法检测p-Akt及Akt蛋白的表达。与对照组相比,顺铂显著上调p-Akt蛋白的表达,而CRM197,顺铂+CRM197显著下调p-Akt蛋白的表达;与顺铂组相比,顺铂+CRM197显著下调P-Akt蛋白的表达。
　　 五、MTT方法检测药物作用24h后对U251细胞生长的影响LY294002,Wortmannin,顺铂+CRM197,顺铂+CRM197+LY294002,顺铂+CRM197+Wortmannin作用U251细胞24h后,应用MTT方法检测各组药物对U251细胞生长的影响。与顺铂+CRM197组相比,顺铂+CRM197+LY294002或Wortmannin显著抑制细胞生长。
　　 六、Annexin V-FITC/PI染色方法检测药物作用24h后对U251细胞凋亡的影响LY294002,Wortmannin,顺铂+CRM197,顺铂+CRM197+LY294002,顺铂+CRM197+Wortmannin作用U251细胞24h后,应用Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡。对照组,LY294002,Wortmannin,顺铂+CRM197,顺铂+CRM197+LY294002,顺铂+CRM197+Wortmannin组的凋亡率(含坏死细胞)分别是5.474±2.28％,20.874±3.40％,18.31±3.68％,45.964±4.69％,64.384±4.30％,68.75±4.52％。与对照组相比,LY294002,Wortmannin,顺铂+CRM197,顺铂+CRM197+LY294002或Wortmannin显著诱导细胞凋亡:与顺铂+CRM197相比,顺铂+CRM197+LY294002或Wortmannin显著诱导细胞凋亡。
　　 七、Western blot方法检测药物作用24h后对U251细胞p-Akt及Akt蛋白表达水平的影响LY294002,Wortmannin,顺铂+CRM197,顺铂+CRM197+LY294002,顺铂+CRM197+Wortmannin作用U251细胞24h后,应用Western blot方法检测p-Akt及Akt蛋白的表达。与对照组相比LY294002,Wortmannin,顺铂+CRM197,顺铂+CRM197+LY294002或Wortmannin显著下调p-Akt蛋白的表达;与顺铂+CRM197组相比,顺铂+CRM197+LY294002或Wortmannin显著下调p-Akt蛋白的表达。
　　 结论：
　　 1、CRM197对胶质瘤U251细胞具有抑制细胞生长、诱导细胞凋亡的抗肿瘤作用。
　　 2、CRM197作用于胶质瘤U251细胞,抑制Akt蛋白的激活。联合应用CRM197和顺铂,CRM197可能通过抑制顺铂引起的P13K/Akt信号通路的激活,提高胶质瘤U251细胞对顺铂的抗肿痛作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略语

论文

前言

实验材料和方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述:CM197开放血肿瘤屏障及治疗脑胶质瘤的应用前景

致谢

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