B7-H1基因沉默对结肠癌细胞生长的抑制作用和对CIK细胞杀伤活性的影响

摘要

目的:
　　 了解肿瘤的免疫抑制机理、打破肿瘤免疫抑制是当今肿瘤免疫治疗的重要和前沿课题。B7-H1/PD-1是肿瘤细胞最主要的负性调节通路之一，B7-H1作为共刺激分子B7家族成员在肿瘤细胞上表达，能够通过受体(如PD-1)诱导初始T细胞增殖，抑制已活化T细胞的增殖和分化，促使其凋亡；PD-1在T细胞的活化后期表达。但是，此通路在肿瘤的发生、发展的何时开始发挥作用，以及如何发挥作用，确切的机理仍然不清。CIK细胞是临床上最为常用的免疫活性细胞，其中有没有能够避开B7-H1/PD-1抑制途径的细胞亚群，或者通过怎样的方法能够解除这种抑制、增强CIK细胞的杀伤活性，仍然不明了，也未见相关的报道。
　　 方法:
　　 采用免疫组织化学染色法检测46例结肠癌、20例结肠腺瘤性息肉及28例结肠慢性炎症患者组织中B7-H1基因的表达，并与临床资料比较，对其中46例结肠癌患者进行电话随访；应用细胞免疫化学染色法检测4株结肠癌细胞及1株人脐静脉内皮细胞中B7-H1蛋白水平的表达；针对B7-H1设计合成RNA干扰片段，连接到pGenesil-1-U6载体上构建shRNA真核表达载体；将上述重组载体转入HCT116细胞内，应用RT-PCR、Real-time PCR及Western blot方法检测转染前后细胞内B7-H1mRNA和蛋白水平的表达抑制率；应用流式细胞术检测转染前后肿瘤细胞周期的变化，同时对转染前后的细胞连续培养7天，应用MTT法绘制细胞生长曲线；选取培养第0、7、14、21天的CIK细胞应用流式细胞术检测CIK细胞免疫表型的变化，同时检测CIK细胞上PD-1的表达；选取转染前后的肿瘤细胞与CIK细胞进行共同培养，设置不同效靶比，观察24、48及72小时后CIK细胞对肿瘤细胞的体外杀伤活性。
　　 结果:
　　 B7-H1在结肠癌组织、腺瘤性息肉及炎症组织的表达率分别为48.39％、10％、10.71％，在结肠癌组织的表达显著高于腺瘤性息肉及慢性炎症组织(P＜0.001)，但与患者年龄、性别、分化程度、浸润程度、临床分期及淋巴结转移无显著相关性；4株结肠癌细胞中，B7-H1在HCT116细胞中表达含量最高，而人脐静脉内皮细胞Huvec虽为阳性表达，但却显著低于结肠癌细胞；shRNA重组质粒转染HCT116细胞后GFP表达强度在48小时达峰值，各组细胞转染效率基本一致，可达61％-69％;经RT-PCR、Real-time PCR及Western blot证实转染重组质粒后，HCT116细胞内B7-H1mRNA及蛋白表达分别下调了60％和68％;生长曲线结果显示，转染重组质粒的细胞生长曲线低平，无明显的对数增殖期，在同一时间内细胞的存活率较低且生长速度也慢于正常肿瘤细胞组及空载体细胞组（P＜0.05）；细胞周期结果显示，转染重组质粒的细胞周期停滞于G1期，而正常肿瘤细胞组及空载体细胞组细胞周期大多集中在S期而非G1期；随着CIK细胞培养天数的增加，CIK细胞内CD3+细胞比例显著上调，CD3+CD4+细胞比例下降，CD3+CD8+及CD3+CD16+CD56+细胞逐渐升高；在同一效靶浓度时，CIK细胞对转染重组质粒的HCT116细胞体外杀伤作用显著升高，随着效靶浓度的升高，CIK细胞的杀伤作用也随之增强（P＜0.05）；检测CIK细胞表面PD-1分子表达显示，CD3+PD-1+的细胞随着CIK细胞培养天数的增加而逐渐上调，且CD4/CD8/CD56三群细胞中PD-1均呈现出较高水平表达，且随者CIK细胞诱导天数的增加，PD-1表现出逐渐增高的趋势。
　　 结论:
　　 B7-H1在结肠癌组织和细胞上表达明显高于炎症组织和结肠腺瘤，但与组织的分化程度、分期等未见明显相关；B7-H1表达的下调可以抑制癌细胞的增殖活性。CIK细胞在诱导过程中PD-1表达逐渐增高，未见有不表达PD-1受体的细胞亚群；但肿瘤细胞B7-H1表达的下调可增强CIK的杀伤作用。本实验表明结肠癌组织中的B7-H1可能作为宿主抗肿瘤免疫干预的效应指标在免疫治疗中发挥着巨大的作用。

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英文缩略语

论文 B7-H1基因沉默对结肠癌细胞生长的抑制作用和对CIK细胞杀伤活性的影响

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实验材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 共刺激分子B7-H1与肿瘤的免疫调节

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