慢病毒介导的CDK8基因的稳定沉默抑制结肠癌细胞生长

摘要

研究目的：
　　探讨慢病毒介导的CDK8基因的稳定沉默在体外和活体水平对结肠癌细胞生长的影响，并阐明其分子机制。
　　方法:
　　1.表达luciferase的结肠癌细胞株的构建
　　将PRC/CMV2-luc真核表达质粒转染SW480细胞，经G418筛选获得稳定表达luciferase的SW480-luc细胞单克隆，挑取单克隆并传代，中间每5代检测一次luciferase的活性，并淘汰luciferase活性低的克隆。一直传代至40代，并比较所建立的稳定表达luciferase的SW480-luc细胞与母细胞SW480的生长特性。
　　2.制备表达针对CDK8基因的shRNA的慢病毒并感染SW480-luc细胞，并筛选得到稳定沉默CDK8基因的单克隆细胞。
　　制备表达针对CDK8基因的shRNA的慢病毒，并感染SW480-luc细胞，然后加嘌呤霉素筛选，挑取单克隆，并建立稳定沉默 CDK8基因的克隆 shCDK8及阴性对照的克隆mock；然后分别用荧光定量PCR和western blotting检测CDK8基因在mRNA和蛋白水平的沉默效率。
　　3.检测CDK8基因的稳定沉默在体外和活体水平对结肠癌细胞生长的影响，并探讨其分子机制。
　　首先用MTT法检测沉默CDK8基因的克隆的细胞增殖，再用荧光定量PCR检测 CDK8所调控基因如 c-Myc和MMP-7的表达；将稳定沉默 CDK8基因的shCDK8细胞及阴性对照的mock细胞分别接种在裸鼠的左右前肢腋下，然后用活体成像系统连续观察肿瘤的生长。
　　结果:
　　1.建立了四株稳定高表达luciferase的结肠癌细胞株SW480-luc，并比较了其与母细胞SW480的生长特性。发现其生长特性与母细胞无明显差别。
　　2.获得稳定沉默 CDK8的细胞克隆及阴性对照克隆各三个，分别命名为shCDK8-1、shCDK8-2、shCDK8-3,阴性对照克隆分别命名为mock-1、mock-2、mock-3。shCDK8克隆相对于SW480的沉默效率为沉默效率分别为74.7％，71.3%，68.5%，而蛋白水平也有明显下调；而mock克隆的CDK8基因相对于SW480-luc在mRNA的表达分别为1.04，1.08和0.96。
　　3.用MTT法连续观察五天shCDK8克隆和mock克隆生长情况，可见shCDK8的三个克隆的增殖速度与mock三个克隆相比明显减慢；用荧光定量PCR检测 CDK8基因所调控的b-catenin、c-Myc和MMP-7基因的表达，发现b-catenin、c-Myc和MMP-7的表达也有明显下调；将 shCDK8-1细胞和mock-1细胞分别接种在裸鼠的左右前肢腋下，可见沉默组的肿瘤生长明显比阴性对照组慢。
　　4.免疫组化结果显示沉默组肿瘤组织中CDK8基因明显下调，荧光定量PCR结果显示沉默组肿瘤组织中CDK8、b-catenin，c-Myc and MMP-7基因明显下调。
　　结论：
　　1.重组shRNA慢病毒可显著下调CDK8基因的表达。
　　2. shRNA慢病毒感染SW480细胞沉默CDK8基因后，能显著抑制细胞的增殖，并且下调c-Myc、MMP-7基因的表达。
　　3. shRNA慢病毒感染SW480细胞沉默CDK8基因后，能显著抑制SW480在裸鼠体内的生长。CDK8基因有望成为结直肠癌靶向基因治疗的新靶点。

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中英文对照词汇表

前 言

稳定表达luciferase的结肠癌细胞株的构建

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

第二部分慢病毒的制备及稳定沉默CDK8基因的细胞克隆的建立

一、材料和方法

二、 结果

三、讨 论

第三部分稳定沉默CDK8基因对结肠癌细胞在体外和活体中的影响

1. 材料与方法

二、结果

三、讨论

结 论

参考文献

综 述

致谢

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