中国HIV-1广谱高效中和抗体筛查研究

摘要

目的:据世界卫生组织报告，至2009年全球共有约3330万HIV/AIDS患者，2009年一年HIV新增加感染者260多万例。我国HIV/AIDS感染报告例数由2000年的每年5000多例增加到2009年的每年68000多例，防治形势十分严峻，迫切需要研发保护性艾滋疫苗。中和抗体是可与病毒结合并消除其感染能力的抗体，可对HIV-1感染提供保护作用。由于HIV-1基因的高度可变性，成功的艾滋疫苗须能引发HIV-1广谱中和抗体，即可广谱中和HIV-1主要流行病毒亚型的抗体。
　　 国外约有10％-30％的HIV-1慢性感染者可产生广谱中和抗体反应，能产生对各种主要哑型均高效的中和抗体更是少之又少。为获得广谱高效中和抗体，美国有研究者使用假病毒技术筛查了1798份来自于不同国家和地区（不包含中国）的HIV-1慢性感染者血清/血浆，仅1％的血清/血浆具有广谱高效中和活性。与国外相比，国内尚无HIV-1广谱高效中和抗体的大规模筛查报道。国内使用假病毒技术分别研究了HIV-1B′亚型慢性感染者和中国长期不进展人群的广谱中和抗体水平，但前者研究亚型单一，后者研究人群局限。虽有研究评价了中国4个地区3个亚型的34例HIV-1慢性感染者的广谱中和抗体水平，但例数过少，无法明确中国地区HIV-1慢性感染者人群广谱中和抗体的存在状况及特点。从具有广谱高效中和活性的血浆中已分离出部分单克隆广谱中和抗体，通过对其晶体结构的研究，发现病毒的一些中和位点，有助于进一步发现HIV-1疫苗免疫原设计中的潜在作用靶位。随着可中和50％以上HiV-1流行株的新单抗(PG9，PGi6)的发现，新的HIV-1疫苗作用靶位也随之被发现。迄今为止从HIV-1感染者中分离到的中和活性最强、中和谱最广的中和抗体是VRC01，它可中和90％以上中国以外地区的HIV-1流行株，但无法中和多数中国地区主要流行株。我国的HIV-1疫苗设计需要依据本国HIV-1感染者的广谱高效中和抗体，迫切需要对中国HIV-1慢性感染者进行筛查，获得我国具有广谱高效中和活性的病例，发现新的HIV-1广谱单克隆抗体，为设计适合我国HIV-1感染者的艾滋疫苗提供依据。
　　 本研究选用B、C、CRF01-AE和CRF07/08_B/C亚型假病毒建立了一个HIV-1广谱高效中和抗体筛查系统，筛查了中国5个主要流行地区4个主要流行亚型的HIV-1慢性感染者血浆，明确中国HIV-1广谱中和抗体存在状况及特点，筛选具有广谱高效中和抗体的病例，为中国HIV-1广谱高效单克隆抗体研究及疫苗开发提供有力支持。
　　 方法:
　　 1、研究对象:未接受HAART治疗、至采血日期感染时间≥1年的HIV-1慢性感染者320例。其中新疆47例(14.69％)，河南159例(49.69％)，吉林34例(1O．63％)，云南56例(17.50％)，辽宁24例(7.50％)。HIV-1B亚型211例，C亚型17例，CRF01_AE亚型10例，CRF07/08B/C亚型54例，其它（包括其它亚型和亚型不详者）28例。每例采集EDTA抗凝的血浆2ml，-80℃冻存。
　　 2、CD4+T细胞绝对值的检测:20μlCD4/CD8/CD3TriTEST试剂加入TruCOUNT管中，加入50μl抗凝血，室温避光15min，加入免洗溶血素450μl，室温避光15min，用FACSMMLTISET软件检测并进行自动分析，得到CD4+T淋巴细胞绝对值。
　　 3、病毒载量测定:以200μl血浆采用标准版模板制备法提取RNA，采用Roche公司HIV-1 Monitor1.5commercialkit在COBAS AMPLICOR自动载量仪上以RT-PCR方法测定病毒载量。检测范围为400-750，000copies/ml。
　　 4、假病毒检测盘1和2的建立:假病毒检测盘1由8个假病毒组成，其中HIV-1B亚型3个，C亚型3个，CRF01-AE亚型2个。假病毒检测盘2由25个假病毒组成，其中B亚型7个，C亚型7个，CRF01AE亚型4个，CRF07/08_B/C亚型5个，对照组假病毒2个。
　　 5、功能性假病毒的获得和滴定:将质粒pSV7d（已连接env基因）和pSG3△env（含有HIV基因组中除env之外的所有基因）共转染293T细胞，37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育48-72h。收集培养上清过滤，-80℃冻存。假病毒做1：5稀释，8个梯度，4复孔。计数TZM-bl细胞，每孔加入104个细胞，加入DEAE-dextran，终浓度30μg/ml。37℃，5％CO2培养48h后吸弃150μl液体，加入100μ1荧光素酶检测试剂。2min后移入96孔黑板中读取发光值，使用Spearman-Karber公式计算半数组织培养感染剂量(TCID50)。
　　 6、假病毒检测盘1的中和检测和计算方法:血浆100倍稀释，加入50TCID假病毒，37℃孵育1h后每孔加入104TZM-bl细胞，37℃，5％C02培养48h后吸弃150μ1液体，加入100μ1荧光素酶检测试剂。2min后移入96孔黑板中读取发光值，计算中和抑制率。中和抑制率为血浆100倍稀释后对假病毒感染的抑制率。中和抑制率计算公式为1-（标本孔发光值-细胞对照孔发光值）/（假病毒对照孔发光值-细胞对照孔发光值）。某亚型假病毒组中和抑制率即指该亚型组内各假病毒中和抑制率的平均值，总体中和抑制率为B、C、CRF01 AE三个亚型组中和抑制率均值的平均值。
　　 7、假病毒检测盘2的中和检测和计算方法:血浆起始稀释倍数45，1：3系列稀释，加入50TCID假病毒，37℃孵育1h后每孔加入104细胞，37℃，5％CO2培养48h后吸弃150μ1液体，加入100μl荧光素酶检测试剂。2min后移入96孔黑板中读取发光值，计算ID50。ID50为抑制病毒50％感染时的血浆稀释倍数。使用Luc5Samples02NotLockedl.xls和Origin8统计软件中的非线性曲线拟合来进行计算。
　　 8、中和活性的评价指标:本研究中假病毒检测盘1中，中和宽度和中和抑制率反映血浆中和活性的强弱，假病毒检测盘2中，主要由中和宽度、ID50、几何平均滴度（ID50的几何平均值）和中和评分反映血浆中和活性的强弱。若血浆针对某个假病毒中和抑制率≥50％，即认为可中和该假病毒。若某血浆可中和某个亚型组中至少一个假病毒，即认为可中和该亚型组。总体中和宽度定义为血浆可中和的亚型组个数，亚型组中和宽度则为血浆可中和该亚型组内的假病毒个数。通过Y=Log3(ID50/100)+1这一公式（＜45者给予ID50为33以便于计算）分别进行计算，赋予假病毒SF162、假病毒MLV权重皆为0，其余假病毒权重相等，计算其加权平均值即为中和评分。广谱高效血浆确认标准：该血浆至少能够中和5个假病毒亚型组中的4个，且平均每个亚型组内ID5o≥300的假病毒个数≥2。
　　 9、统计学处理:用SPSS11.5统计软件和Origin8进行统计分析；用Spearman等级秩相关进行相关性分析；使用Mann-Whitney U检验进行差异性分析；P＜0.05为有统计学意义。
　　 结果:
　　 一、假病毒检测盘1检测结果
　　 1、中和宽度和中和抑制率分析：为评价假病毒检测盘1中血浆的中和活性，对其中和宽度和中和抑制率进行了分析。35％的血浆总体中和宽度为3，B和C亚型组中和宽度正相关，总体中和宽度与CD4+T细胞计数、病毒载量水平无相关。云南B亚型血浆的C亚型组中和宽度高于辽宁、河南、吉林。B亚型假病毒组中和抑制率均值为0.47±0.30;C亚型假病毒组中和抑制率均值为0.40±0.32;CRF01_AE亚型假病毒组中和抑制率均值为0.31±0.30;总体中和抑制率均值为0.39±0.22。总体中和抑制率和感染时间正相关。对于B亚型血浆来说，云南总体中和宽度高于辽宁；辽宁、河南,感染时间高于云南；云南总体中和抑制率显著高于河南、辽宁、吉林;B业型假病毒组中和抑制率显著高于C和CRF01_AE亚型。
　　 2、血浆筛选结果：320例血浆，能够中和6个以上假病毒的血浆45例(14.1％)：7个以上22例(6.9％)；能够中和全部8个假病毒的血浆10例(3.1％)。有研究发现经过最初筛选后，约有5％血浆进入最终筛选，本次研究若选择可中和6个以上假病毒的血浆进入假病毒检测盘2，为45例(14.1％)，与“5％”差距过大；若选择可中和全部8个假病毒的血浆进入假病毒检测盘2，则仅为10例(3.1％)，比例过小，易漏查具有广谱高效中和活性的血浆；故选择可中和7个以上假病毒的血浆进入假病毒检测盘2，为22例(6.9％)，与“5％”差距最小。22例血浆经假病毒VSV-G检测，计算50倍稀释后对假病毒感染的抑制率，结果均≤40％，排除服药可能。22例中河南7例(31.8％)；云南6例(27.3％)：吉林4例(18.2％)；新疆5例(22.7％)；B′亚型12例，C亚型4例，CRF07_B/C亚型5例，亚型不详1例；中和宽度均为3。感染时间＞10年的12例(54.5％)；5-10年的3例(13.6％)；＜5年的2例(9.1％)；感染时间不详但确认≥1年的5例(22.7％)。
　　 二、假病毒检测盘2检测结果
　　 1、几何平均滴度分析：云南血浆几何平均滴度均值为312±184.7，新疆为125±44.6，河南为104±35.7，吉林为102±33.3。云南血浆几何平均滴度显著高于新疆，河南和吉林。
　　 2、血浆筛选结果：中和评分≥2的3例(13.6％)；≥1且＜2的11例(50.0％)；其余8例均＜1(36.4％)；15例可中和假病毒检测盘2上全部5个亚型假病毒组，其余7例可中和假病毒检测盘2上4个亚型假病毒组。其中3例(YN043、YN014、YN025)具有HIV-1广谱高效中和活性，都来自中国云南德宏地区，可中和假病毒检测盘2上全部5个亚型假病毒组，约占血浆总量的1％，均为男性。其中YN043为HIV-1C亚型，中和评分为2.64，几何平均滴度为603，CD4+T细胞计数为358，病毒载量为23000，传播途径为IDU，采血时间为2006年，采血时年龄25岁，可中和23个假病毒，于2009年3月16日开始HAART治疗，至今存活；YN014为HIV-1C亚型，中和评分为2.34，几何平均滴度为435，CD4+T细胞计数为526，病毒载量为27600，传播途径为IDU，采血时间为2006年，采血时年龄36岁，可中和21个假病毒，已死亡；YN025为HIV-1B′亚型，中和评分为2.12，几何平均滴度为343，CD4+T细胞计数为366，病毒载量为9570，传播途径为hetero，采血时间为2006年，采血时年龄25岁，可中和21个假病毒，未治疗，已失访。
　　 结论：
　　 1、中国HIV-1慢性感染者人群中约有35％具有HIV-1广谱中和抗体，其存在状况与国外人群相近。
　　 2、获得了3例(YN043、YN014和YN025)具有HIV-1广谱高效中和抗体的HIV-1慢性感染者病例，占1％，我国广谱高效中和抗体的存在状况与国外人群相近。
　　 3、中国HlV-1B亚型血浆对B亚型假病毒的中和活性高于对C、CRFO1__AE亚型假病毒的中和活性。

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文摘

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英文缩略语

论文 中国HIV-1广谱高效中和抗体筛查研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 HIV-1假病毒的研究进展

参考文献

致谢

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