中国HIV-1流行株对广谱中和抗体VRC01敏感性的分子机制研究

摘要

人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)膜区的糖蛋白具有高度的变异性，可以导致病毒逃逸人体内发生的抗原抗体反应，是人类研究有效的艾滋病疫苗的主要障碍。在过去四年中，通过综合应用先进的技术策略，研究者们分离发现了多个完全人源的具有高效中和能力的单克隆广谱中和抗体。根据广谱中和抗体设计相应的疫苗成为HIV-1疫苗研究的热点方向。VRC01，是研究者采用高通量特异性扩增单个B细胞抗体的技术于2010年发现的具有广谱中和活性的单克隆抗体。研究表明，VRC01作用于HIV-1膜蛋白表面的CD4结合位点，主要作用于gp120蛋白的loop D区域、CD4结合区和V5区域。VRC01能够高效中和90％以上的国内外HIV-1流行株。但在研究中仍发现了少数的分离毒株对VRC01具有不同程度的耐受，深入研究这些流行毒株对广谱中和抗体VRC01的耐受机制，并阐明耐受株在体内免疫选择压力作用下对VRC01的中和敏感性的变化规律，能够帮助人们更好地了解病毒与广谱中和抗体的相互作用机制，同时能够为抗体相关疫苗的研制和应用提供重要的信息。
　　 为了研究中国HIV-1流行株与广谱中和抗体VRC01的相互作用特点并揭示流行株中耐受毒株的耐受机制，本研究首先通过序列比对分析和假病毒的中和实验筛选到分离自同一份HIV-1 CRF08_ B'C亚型感染者样本的两株病毒CNE47和CNE48，这两株病毒的膜蛋白序列高度相似，94％以上的氨基酸序列完全相同，在与VRC01相互作用的主要区域中，loopD区域仅有一个氨基酸的差异，CD4结合区则完全相同，V5区域有4个氨基酸不同。但是这两株病毒对VRC01的中和敏感性相差24倍左右，其中CNE47对VRC01相对不敏感(IC50=9.27μg/ml)，对VRC01表现出一定程度的耐受，而CNE48则对VRC01高度敏感(IC50=0.39μg/ml)。对CNE47和CNE48的loop D和/或V5区域进行了整体互换和单个氨基酸的突变，结果表明，包含有V5区域互换的突变株对VRC01的中和敏感性都发生了明显的变化。因此，V5区域的不同是导致CNE47和CNE48对VRC01中和敏感性不同的主要原因。另外，将CNE47的460位的天门冬酰胺突变为丙氨酸(N460A)时，可以显著增强病毒对VRC01的中和敏感性。我们选取了来自不同感染者的毒株CNE23和CNE30进行了进一步的验证，结果发现，在这些毒株中，V5区域同样是决定病毒对VRC01中和敏感性的主要区域，其中460位的天门冬酰胺(N460)也能够促进病毒对VRC01的耐受。结构模拟分析结果表明，HIV-1 gp120的460位的天门冬酰胺可以增加VRC01重链的61位精氨酸与gp120之间的空间位阻，进而促进病毒对VRC01的耐受。假病毒的膜蛋白与VRC01的结合实验证明，病毒对VRC01的结合能力决定了其对VRC01的中和敏感性。随后，我们研究了含有突变的病毒对其它的CD4结合位点相关蛋白和抗体的敏感性变化，结果表明:loop D和V5区域的变化都没有明显影响病毒对b12的敏感性;在突变株中仅有包含有潜在糖基化位点的突变降低了相应假病毒对Ibalizumab的中和敏感性，但V5区域的变化促进了病毒对可溶性CD4(soluble CD4，sCD4)蛋白的不同程度的中和耐受。
　　 为了进一步研究在免疫选择压力下，体内病毒种群的变化情况和病毒对VRC01中和敏感性的变化情况，我们对分离出CNE47和CNE48的50号感染者的后续两个时间点的系列样本进行了研究。首先从后续样本中扩增出了大量的HIV-1膜蛋白基因，通过序列分析、假病毒构建和中和实验等方法研究了代表性毒株对VRC01及其它CD4结合位点相关抗体的中和敏感性的变化。结果表明，分离自同一份样本的HIV-1膜蛋白序列的亲缘关系最近。在gp120与VRC01相互作用的主要区域中，与CNE47相比，后续系列样本中分离出的病毒膜蛋白的loop D区和CD4结合区完全相同，V5区域存在1个或5个氨基酸的差异。代表克隆对VRC01、b12和Ibalizumab的中和敏感性均与CNE47相似。这说明，在50号感染者体内，后续时间点分离出的所有毒株均对VRC01耐受。通过本研究可以得出以下结论:
　　 1、在HIV-1中，gp120蛋白的V5区域是决定病毒对VRC01中和敏感性的主要区域。
　　 2、V5区域中460位的天门冬酰胺能够促进病毒对VRC01的耐受。
　　 3、HIV-1膜蛋白与VRC01的结合能力决定了病毒对VRC01的中和敏感性。
　　 4、在同一感染者体内可以同时存在对VRC01中和敏感性不同的HIV-1毒株种类，但对VRC01耐受的毒株可以克服体内的选择压力，成为病毒的主要优势种群。

目录

声明

摘要

前言

研究路线

实验材料

实验方法

实验结果

1 毒株筛选结果

2 HIV-1突变株对VRC01的中和敏感性

3 HIV-1突变株对VRC01的中和敏感性与结合能力的关系

4 HIV-1突变株对其它CD4结合位点相关的蛋白及抗体的中和敏感性

5 对VRC01耐受的毒株在感染者体内的变化规律

讨论

结论

参考文献

个人简历

致谢