恩度对肿瘤上清液诱导的血管内皮细胞迁移、成管能力及MMP-2、MMP-9活性的影响

摘要

前言：
　　 血管生成对于胚胎发育和所有生后组织的生长及修复来说都是至关重要的。血管生成是一个包含基底膜降解、内皮细胞粘附性降低、内皮细胞增殖并向周围基质迁移、内皮细胞再粘附组成新的毛细血管腔的复杂的多阶段过程。
　　 20世纪70年代早期有人提出了肿瘤相关性血管生成的概念。实验表明如果没有新生血管,肿瘤最多只能长到2-3mm3。血管生成是癌症进展过程中的关键性一步。因此推测,可通过抑制血管内皮细胞的迁移和成管能力来抑制肿瘤血管生成,从而抑制肿瘤的生长。
　　 基质金属蛋白酶(MMPs)是高度保守的依赖于锌离子的内切蛋白水解酶家族,能够选择性消化细胞外基质和非基质蛋白。Ⅳ型胶原是细胞外基质和基底膜的主要结构蛋白,Ⅳ型胶原酶MMP-2、MMP-9是降解Ⅳ型胶原最主要的酶,在血管生成早期的血管基底膜的降解中起重要作用。因此抑制MMP-2和MMP-9的活性可以有效防止血管基底膜的降解,减少肿瘤血管生成。
　　 出生后的血管生成是血管生成刺激因子和抑制因子共同作用的平衡结果,一旦失衡可以导致炎症、肿瘤、缺血和免疫异常等疾病[1]。抑制因子中包含一种被称为内皮抑素的物质。自然条件下,内皮抑素的生成量很低。而人工合成的内皮抑素临床疗效又不理想。恩度(Endostar)是一种新型的重组人血管内皮抑素,理论上能有效抑制肿瘤中的血管生成,阻断肿瘤细胞营养和氧气的供应,最终使肿瘤细胞因缺乏营养供给而死亡。因此推测,恩度作为一种新型的血管生成抑制剂具有广谱的抗血管源性蛋白质的功能,同时恩度作为血管生成的直接抑制剂有以下优点:血管内皮细胞对其几乎没有耐药性,可以长期使用而不会引起肿瘤复发[2,3],临床研究发现恩度单药应用也具有一定的抗肿瘤作用,且安全性好[4,5]。但是其能否特异性地作用于肿瘤微环境下的血管内皮细胞,抑制其迁移、形成新的血管,从而抑制肿瘤的生长尚有待进一步研究。
　　 实验方法：
　　 一、细胞培养及实验分组
　　 将HUVEC置于含有10％FBS的DMEM培养液中,在37℃、5％CO2培养箱(FORMA)中培养,用0.125％胰酶(含0.02％EDTA)消化、传代。在细胞培养及恩度干预后,在倒置相差显微镜下观察细胞形态。实验分组为恩度浓度分别为0μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml,作用于HUVEC24小时。
　　 二、Transwell小室检测HUVEC的迁移能力
　　 配制HUVEC悬液,调整细胞密度为1×106个/ml。将10μl细胞悬液加入Transwell迁移系统的上层小室中,再将上层小室放入含有10％肿瘤上清液和浓度分别为0μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml恩度的培养孔中,37℃孵育24 h。PBS洗涤细胞3次,4％甲醛固定30 min,PBS再洗细胞3次,姬姆萨染色。用棉棒仔细去除上层小室侧的未迁移细胞,观察已穿过迁移杯8μm孔到达迁移杯底下面的细胞。显微镜下随机选取5个视野进行拍摄,计数每个视野的平均细胞数量。三、Matrigel检测HuVEC的成管能力
　　 将HUVEC接种于24孔板,每孔约1×106个,培养24小时,弃上清液,加入含有10％肿瘤上清液和浓度分别为0μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml恩度的培养液,继续培养24小时。将细胞用胰酶消化吹打,制成细胞悬液。将Matrigel涂于另一24孔板,每孔5μl,涂匀后培养箱内静置30分钟,待胶凝固,将细胞悬液接种于涂有Matrigel的24孔板内,继续培养24小时。在倒置显微镜下观察管腔形成情况,每孔随机选取5个视野计数管腔数目,并取平均值。
　　 四、明胶酶谱实验测定HUVEC中MMP-2、MMP-9的活性
　　 取对数生长期细胞,用DMEM培养液调整细胞密度为2×105/ml,接种于24孔板,培养24h后离心去上清液,加入含有10％肿瘤上清液和浓度分别为0μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的恩度,孵育24h后收取上清液。用Lowry's法测定上清液中的蛋白浓度,电泳前将样本总蛋白量调整至70μg/μl,再按5:1与上样缓冲液混合孵育30min,上样于含0.8g/L聚丙烯酰胺凝胶中。作SDS-PAGE,初始电压为80V电泳30min,待溴酚蓝达分离胶后加至150V电泳70-80min。电泳所得凝胶依次洗脱(40分钟,两次),漂洗(20分钟,两次),孵育(48小时,37℃),用考马斯亮蓝染色4h,再脱色。凝胶图像扫描入计算机后即可对其条带进行半定量分析。
　　 五、统计学分析
　　 实验数据采用SPSS13.0统计分析软件进行单因素方差分析和t检验,P＜0.05有统计学意义。
　　 实验结果
　　 一、恩度对HUVEC迁移能力的影响
　　 Transwell小室检测显示,不同浓度恩度作用24小时对肿瘤上清液诱导的HUVEC的迁移能力有抑制作用,并呈剂量依赖性。
　　 二、恩度对HUVEC成管能力的影响
　　 不同浓度恩度作用于肿瘤上清液诱导的HUVEC24小时,可明显减少HUVEC形成的管腔数目,并呈剂量依赖性。
　　 三、恩度对HUVEC中MMP-2、MMP-9活性的影响
　　 明胶酶谱实验显示,不同浓度恩度作用于肿瘤上清液诱导的HUVEC24小时后,MMP-2和MMP-9的活性较对照组减弱。
　　 结论：
　　 1、恩度可抑制体外培养的肿瘤上清液诱导的人脐静脉内皮细胞的迁移,使人脐静脉内皮细胞的迁移能力降低。
　　 2、恩度可以抑制体外培养的肿瘤上清液诱导的人脐静脉内皮细胞的成管能力,使人脐静脉内皮细胞在Matrigel中形成的管腔数目减少。
　　 3、恩度能够抑制体外培养的肿瘤上清液诱导的人脐静脉内皮细胞中MMP-2和MMP-9的活性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略语

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述:恩度抗肿瘤作用的研究进展

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