NO抵制并疟原虫裂殖子侵入红细胞相关分子机制的实验研究

摘要

实验目的：
　　 疟疾是疟原虫通过媒介昆虫蚊传播的人类最为严重的寄生原虫感染性疾病。《Nature》公布的统计数据显示，世界上100多个国家为疟疾流行区，约22亿人口受到疟疾威胁，每年有300～500万疟疾临床病例，病死人数高达110～270万。为此，疟疾的广泛流行给全球尤其是发展中国家带来了沉痛的健康危害和严重的经济负担。疟疾发病主要源于疟原虫在宿主红细胞内的裂体增殖，而阻断疟原虫对红细胞的侵入是控制疟疾发病的关键因素。
　　 疟原虫要完成在宿主体内红内期的发育，必须通过自身的配体识别宿主红细胞上的相应受体，从而完成侵入的过程。因此，疟原虫表达的配体分子和相应红细胞的受体之间的相互作用是疟原虫侵入过程中的关键环节。虽然不同种属的疟原虫入侵不同发育阶段的宿主红细胞(如:间日疟原虫(Plasmodium vivax，Pv)入侵网织红细胞，卵形疟原虫(Plasmodium ovale，Po)入侵成熟的红细胞，而恶性疟原虫（Plasmodium falciparum，Pf）可入侵所有发育阶段的红细胞），但是各种属疟原虫均具有相同的形态学特征和胞浆内器官。这一相似的结构学特征提示，入侵过程中所需的分子机制可能相同。
　　 近年来，随着疟原虫-红细胞相互作用分子机制研究的深入进行，如裂殖子表面蛋白1(Merozoite surface protein-1，MSP-1)、顶端膜抗原1(Apical MembraneAntigen-1，AMA-1)等在侵入过程中发挥重要作用的分子，其结构和功能已逐渐明确，相应的疟疾疫苗也已进入Ⅰ期临床试验阶段。此外，对裂殖子顶端复合体（一种在原虫入侵过程中发挥重要作用的顶端结构）的研究进一步发现，其组成成分之一的棒状体(Rhoptry)在入侵过程中也发挥重要作用。棒状体由多种蛋白分子组成，是介导疟原虫纳虫空泡(Parasitophorous vacuole，PV)形成的重要结构。恶性疟原虫棒状体中大分子蛋白RhopH复合体组成分子分别为RhopH1(155kDa)、RhopH2(140kDa)和RhopH3(110kDa)。约氏疟原虫(Plasmodiumyoelii，Py) RhopH复合体依照其恶性疟原虫同系物分别被命名为PyRhopH1A(135kDa)、PyRhopH2(140kDa)和PyRhopH3(100kDa)。众所周知，体现疟原虫毒力不同的一个鲜明特点是其裂殖子识别和入侵宿主红细胞的发育阶段不同，近年研究发现此种选择性识别入侵机制与棒状体各组成蛋白间关系密切。体内外实验观察均发现，抗RhopH复合体的特异性抗体可抑制疟原虫的生长发育。利用基因敲除技术对疟原虫的研究过程中发现恶性疟原虫PfRhoph3基因敲除的疟原虫无法存活，提示RhopH complex赋予了疟原虫重要的生物学作用。Preiser等人也报道约氏疟原虫棒状体内另一种分子量为235kDa(Py235)的蛋白与裂殖子对红细胞的粘附及致病力显著相关，基因组分别定位于约氏疟原虫第1、5、6和10号染色体的亚端粒区。Py235与间日疟原虫网织红细胞粘连蛋白2(RBP-2)、恶性疟原虫红细胞粘连蛋白PfRBP2-Ha和PfRBP2-Hb的基因结构高度近似。蛋白功能分析显示，抗Py235蛋白的单克隆抗体可改变致死性YM株（可感染所有发育阶段的疟原虫）的感染模式，使其与自限性17X株（只感染网织红细胞）的感染模式相同。这些结果进一步提示RhopH复合体和Py235各家族成员与裂殖子表面分子MSP-1和AMA-1共同参与疟原虫-红细胞粘附机制，并在疟原虫入侵宿主红细胞中发挥重要的选择性作用。
　　 不断积累的研究数据表明:疟原虫感染早期有效的Th1型免疫应答的建立，在遏制疟原虫的裂体增殖和介导疟疾感染结局方面发挥着关键的作用。一氧化氮(NO)作为Th1型免疫应答的效应分子，在免疫防御中具有不可忽视的作用地位。NO由L-精氨酸在转变成胍氨酸过程中经一氧化氮合酶(NOS)催化形成，可由机体的多种组织细胞产生。其中，诱导型一氧化氮合酶（iNOS或NOS2）诱导产生的NO在抗肿瘤发生、诱导肿瘤细胞凋亡和抗菌、抗病毒及胞内寄生性原虫等多种病原生物感染过程中，发挥着重要的免疫防御作用。疟原虫红外期研究结果显示，NO可明显消除疟原虫子孢子对肝细胞的感染。我们前期的蚊阶段研究观察发现，约氏疟原虫感染早期自然传播阻断现象的出现不是发生在蚊体内，而是发生于感染宿主体内，并且与宿主NO产生密切相关。NO可直接抑制配子体向配子的进一步发育。然而，与肝内期和蚊阶段相比，NO在抗红内期疟原虫免疫机制中的作用尚未清楚。一些学者认为NO是控制和消除红内期虫体血症的重要免疫效应分子。iNOS产生增加与感染小鼠存活时间延长密切相关，恶性疟原虫感染过程中，无并发症疟疾患者外周血iNOS mRNA水平显著升高且单核细胞数量增加;同时，NO还可通过抑制感染恶性疟原虫的红细胞对微血管内皮细胞的粘附保护易感宿主;应用NO发生剂进行的体外实验也显示，NO通过细胞毒效应可明显抑制夏氏疟原虫、柏氏疟原虫和恶性疟原虫红内期原虫的生长及发育。然而，也有结果显示:应用iNOS抑制剂氨基胍(AG)治疗后，夏氏疟原虫感染小鼠的虫体血症水平和存活时间并未出现明显的变化;用痤疮丙酸杆菌诱导巨噬细胞产生高水平的NO或注射NOS抑制剂，小鼠的虫体血症水平也未见有意义的改变。提示NO水平的升高并不足以清除红内期感染。然而，某些学者认为NO之所以不能有效杀伤红内期疟原虫（环状体、滋养体、裂殖体），可能是NO在红细胞内弥散过程中被血红蛋白耗竭，因而到达疟原虫体的有效NO浓度降低，不能发挥其非特异性杀伤效应。而裂殖子是疟原虫唯一不被宿主红细胞保护、完全裸露于宿主免疫系统之下，易受效应分子攻击的发育阶段。因此，深入探讨NO在红内期保护性免疫应答中的作用地位，特别是阐明NO介导裂殖子与红细胞相互作用的分子机制具有重要的科学意义。
　　 关于NO介导疟原虫侵入宿主红细胞的分子机制至今尚无报道。为此，本研究是在上述系统研究的基础上，拟利用我们成功建立的Py17XL易感和抵抗鼠疟模型，通过动态监测红细胞感染率、利用NO合成前体物质L-精氨酸干预两种鼠疟模型免疫应答特点及效应;体内、外监测NO产生水平变化对PyMSP1-19、PyAMA-1、PyRhopH复合体和Py235转录和表达模式及其介导疟原虫粘附机制的影响，以及在疟原虫感染周期中Py235表达变异体的种类和其表达模式。进一步确定裂殖子侵入红细胞的分子机制，以期为探讨控制疟疾发病的免疫治疗提供新的作用靶位，同时为开发高效的疟疾发病阻断疫苗提供新的理论和实验依据。
　　 实验方法：
　　 1、实验动物感染及其模型建立
　　 6-8周龄、雌性DBA/2和BALB/c小鼠，经腹腔分别感染1×106 P.y17XL寄生的红细胞(pRBC)，构建不同的实验动物模型。感染不同时间的小鼠经尾静脉采血，制备薄血膜，Giemsa染色，镜检计数红细胞感染率。L-精氨酸体内处理组小鼠实验组于疟原虫感染前连续口服给予L-Arg(1.5g/kg BW)7d，对照组在感染前同样时间点给予同体积生理盐水。一氧化氮发生剂配置，用无菌1×PBS配制25mmol/LNOC18，2.5 mmol/LNOC18，100 mmol/LNOC5和25 mmol/LNOC5，长效发生剂NOC18于小鼠感染后第2天尾静脉注射，100ul/次/日，短效发生剂NOC5于感染后6d腹腔注射100ul/只，孵育30min;用RPMI-1640含小牛血清培养液配制1.25mmol/L,2.5 mmol/L，5mmol/L和10 mmol/LNOC5短效一氧化氮发生剂用于体外实验，37℃，5％CO2，孵育30min。
　　 2、疟原虫成熟裂殖体纯化
　　 肝素抗凝，心脏采集感染后第6d小鼠血液(红细胞感染率达60％～80％)，经灭菌纤维素(CF)11过柱，去除白细胞，50％ Percoll密度离心法进一步分离、收集疟原虫裂殖体。
　　 3、脾细胞培养及树突细胞(DCs)的纯化
　　 无菌取出感染小鼠脾脏，制成细胞悬液并调整脾细胞终浓度为1×107/ml，24孔培养板上加入细胞悬液，500ul/孔，于37℃培养48h。350g室温离心10min，收集上清，-80℃保存，待IFN-γ和NO检测。按照小鼠DCs纯化试剂盒说明书所示，从小鼠脾细胞悬液中阴性选择纯化脾DCs。将脾DCs终浓度调整为1×106/ml，于24孔培养板中，每孔加入500ul，培养48h后，收集培养上清，-80℃保存，待IL-12p40检测。
　　 4、采用双抗体夹心ELISA法检测小鼠感染疟原虫后脾细胞培养上清中IFN-γ和树突细胞培养上清中IL-12p40的含量
　　 用双抗体夹心ELISA法对IFN-γ和IL-12p40含量进行检测，酶标仪检测450nm处OD值，应用SoftMaxPro4.3.1 LS软件分析，绘制标准品标准曲线，计算细胞因子含量(pg/ml)。
　　 5、NO2-测定
　　 Griess方法检测经培养48h脾细胞上清中NO2-水平。计算其含量(μM)。
　　 6、流式细胞分析技术检测L-Arg体内干预小鼠感染疟原虫后，脾树突细胞亚群及巨噬细胞活化情况
　　 (1)每份样品用抗-CD11 c-FITC单克隆抗体、抗-CD111b-PE单克隆抗体和抗-B220-Percp单克隆抗体进行三色分析，另设阴性对照管。预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1ml，再加入抗-CD11 c-FITC单克隆抗体、抗-CD11b-PE单克隆抗体和抗-B220-PerCP单克隆抗体进行表面染色。离心去上清后，洗涤两次，静置15min，流式细胞仪进行检测。
　　 (2)每份样品用抗-F4/80-FITC单克隆抗体和抗-CD36-PE单克隆抗体进行双色分析，另设阴性对照管。预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1ml，再加入抗-F4/80-FITC单克隆抗体和抗-CD36-PE单克隆抗体进行表面染色。离心去上清后，洗涤两次，静置15min，流式细胞仪进行检测。
　　 7、实时定量RT-PCR方法检测侵袭相关分子的转录水平
　　 (1) PCR引物利用引物设计软件Primer5设计约氏疟原虫MSP-1、AMA-1、RhopH复合体、Py235家族以及β-actin的特异性引物。
　　 (2) Real-time RT PCR检测转录水平差异:按照TAKARA荧光法Real-timePCR两步法试剂盒说明书，合成cDNA并进行实时定量PCR实验。利用相对定量法检测PyMSP1-19、PyAMA-1、PyRhopH2复合体和11个py235基因家族成员的转录水平，t检验比较转录水平的差异。
　　 8、Western blotting对比检测侵袭相关分子的翻译水平
　　 将裂殖体在100ul含有蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲液中-80℃冻融3次，每次冷冻时间30min，在10％ Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)中分离蛋白。分别应用抗PyAMA-1、PyRhopH复合体作为一抗，二抗用羊抗小鼠或羊抗兔HRP荧光抗体，ECL发光法检测相应蛋白表达水平。
　　 实验结果：
　　 1、P.y17XL感染DBA/2和BALB/c小鼠后不同时间脾脏DCs亚群的数量
　　 BALB/c和DBA/2小鼠脾脏髓样树突细胞(CD11 c+CD11b+DCs)的数量于感染后3、5d均明显升高，并且DBA/2小鼠的髓样细胞数量和BALB/c小鼠相比具有增高趋势。而两种小鼠脾脏浆样树突细胞(CD11c+CD45R/B220+DCs)的数量在感染后3、5d，也呈逐渐增高趋势，但BALB/c小鼠浆样树突的数量显著高于DBA/2小鼠。
　　 2、细胞培养上清中Th1型细胞因子IL-12p40和IFN-γ以及免疫效应分子NO的分泌水平
　　 感染后第3d，DBA/2小鼠DCs培养上清中IL-12p40的水平迅速升高，第5d尽管呈下降趋势，但仍明显高于正常水平。相比，BALB/c小鼠DCs培养上清中IL-12p40的水平在感染后第3d和第5d均未见有意义的升高;BALB/c和DBA/2两种小鼠于感染后第3～5d的IFN-γ水平均出现有意义的升高;但DBA/2小鼠IFN-γ产生水平显著高于BALB/c小鼠。两种小鼠NO水平于感染后第3～5d也出现有意义升高，但DBA/2小鼠NO升高的水平明显高于BALB/c小鼠。
　　 3、L-Arg处理后不同时间P.y17XL感染DBA/2和BALB/c小鼠脾脏DCs亚群的数量
　　 L-Arg处理组的BALB/c小鼠髓样和浆样DCs于感染后3、5d明显升高，显著高于Py17XL正常感染组，从两种DCs亚群的活化程度来看，BALB/c正常感染组小鼠浆样DCs略占优势，而L-Arg处理的BALB/c感染组小鼠髓样DCs活化程度明显优于浆样DCs; L-Arg处理组的DBA/2小鼠髓样和浆样DCs于感染后3、5d明显升高，并且以髓样DCs活化为主。
　　 4、两种小鼠经L-Arg处理感染Py17XL后不同时间脾巨噬细胞的数量
　　 Py17XL感染DBA/2和BALB/c小鼠正常感染组和经L-Arg处理组，巨噬细胞在感染后3、5d数量均高于未感染小鼠，但两组小鼠之间无统计学差异，但两组小鼠活化的巨噬细胞数量存在明显不同，在感染后3d，L-Arg处理组小鼠巨噬细胞的活化数量明显高于正常感染组。
　　 5、Py17XL感染BALB/c和DBA/2小鼠经L-Arg处理后不同时间脾细胞培养上清中IFN-γ和NO的水平
　　 BALB/c和DBA/2小鼠经L-Arg干预后，小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ和NO水平明显高于正常感染组，特别是有利于BALB/c小鼠IFN-γ和NO的产生，小鼠于感染后5d IFN-γ的水平仍高于正常感染组。
　　 6、通过Real Time RT-PCR检测NO发生剂体内处理Py17XL感染BALB/c小鼠，各侵袭相关分子基因的转录模式
　　 NO短效发生剂NOC5对重要的疟原虫红内期侵袭蛋白AMA1，MSP1和RhopHcomplex具有一定的抑制作用，并且这种抑制作用在AMA1和MSP1两个呈剂量依赖性;NO长效发生剂NOC18显示对AMA1，MSP1和RhopH complex这三个基因的转录水平不如短效发生剂明显，仅在高浓度时对MSP1的转录水平起到上调作用而在低浓度时对RhopH complex转录起到抑制作用，但不如NOC5有规律可循。对Py235家族的转录水平的影响可见长效NO发生剂NOC18对＃2104和＃5054具有抑制作用，而对＃3534在浓度高时具有抑制作用而在浓度低时具有上调作用;短效NO发生剂NOC5对Py235家族的影响显示对＃2104和＃3534具有上调作用，高浓度时对＃4930具有上调作用，而对其他家族基因具有下调作用。
　　 7、通过Real Time PCR检测NO短效发生剂NOC5不同浓度体外处理Py17XL纯化裂殖体，各侵袭相关分子基因的转录模式
　　 NO短效发生剂NOC5体外处理Py17XL纯化裂殖体可见对RhopH complex的转录水平未见影响，对AMA1和MSP1在浓度5mmol/L时具有一定上调作用，而在浓度10mmol/L时对MSP1水平具有一定下调作用;而对Py235家族基因的转录水平表现在浓度1.25mmol/L时对＃2104，＃3184，＃3432和＃4930具有一定下调作用，在浓度2.5mmol/L时对＃2104具有下调作用而对＃3184和＃4930具有一定的上调作用，在浓度5mmol/L时对＃649有上调作用而对＃2104具有下调作用，而在10mmol/L时对＃649，＃1365以及＃2104具有下调作用。
　　 8、通过Western Blot检测NO发生剂体外处理致死型约氏疟原虫裂殖体AMA1和RhopH complex蛋白的表达模式
　　 体外不同浓度短效NO发生剂NO5(1.25mmol/L，2.5mmol/L，5mmol/L和10mmol/L)处理纯化的Py17XL裂殖体，利用Western Blot检测AMA1和RhopHcomplex蛋白的表达显示，NOC5对AMA1表达具有抑制作用，并且这种抑制作用具有剂量依赖性，而NOC510mmol/L时对RhopH complex蛋白具有抑制作用。
　　 结论：
　　 1、P.yoelii17XL感染早期，易感小鼠BALB/c和抵抗小鼠DBA/2在Th1型细胞免疫应答存在明显差异，这种Th1型免疫应答可能是通过DCs分泌IL-12介导的。
　　 2、P.yoelii17XL感染早期，易感小鼠BALB/c和抵抗小鼠DBA/2在巨噬细胞产生数量和NO产生水平存在明显差异。
　　 3、L-Arg能显著降低感染BALB/c和DBA/2小鼠的原虫血症水平并延长易感小鼠的生存率。
　　 4、L-Arg通过DCs活化来强化Th1型应答进而遏制P.y17XL感染早期红内期疟原虫的感染进程。
　　 5、100ul，25mmol/L和100mmol/L NO5体内注射Py17XL感染BALB/c小鼠30min可下调决定疟原虫侵入的关键蛋白MSP1和AMA1的转录水平，并呈剂量依赖性。
　　 6、NO发生剂（长期或短期）体内干预P.y17XL感染BALB/c小鼠，疟原虫在NO压力下由弱毒力株向强毒力株转变。
　　 7、体外不同浓度NOC5干预Py17XL裂殖子，对疟原虫蛋白AMA1具有抑制作用，并且这种作用具有剂量依赖性。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 NO对致死型约氏疟原虫裂殖子侵袭力的影响及发生机制的研究

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

论文二 L-精氨酸对Py 17XL感染的不同种属小鼠免疫效应及其机制的研究

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

论文三 NO对疟原虫侵袭相关分子MSP1、AMA-1、RhopH complex和Py235转录和翻译模式的影响

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结果

参考文献

本研究创新性的自我评价

综述

在学期间科研成绩

致谢

个人简历