碘缺乏致大鼠仔鼠小脑神经发育障碍及对相关蛋白Doublecortin、Reelin、Caveolin-1、Synaptotagmin-1表达的影响

摘要

目的:
　　 碘(Iodine，Ⅰ)是一种人体必需的重要的微量元素，在体内主要通过合成甲状腺激素(Thyroid Hormone，TH)，并影响后者的合成与分泌活动进而发挥其生理功能。甲状腺功能的正常发挥直接受膳食中碘含量的调节。甲状腺激素是机体正常生长发育所必需的激素，具有促进组织分化、生长与发育成熟的作用，对中枢神经系统的发育尤为重要。自然环境中缺碘可造成碘缺乏病。碘缺乏是导致人类神经系统发育损伤的重要原因之一。目前我国孕期碘供应不足的状况令人堪忧，母体碘的缺乏可直接导致子代发育期甲状腺激素供应不足，致使子代生长发育障碍，尤其是中枢神经系统的发育障碍。碘缺乏对新生儿生长发育有广泛及严重的危害性，已成为严重影响人口社会发展的重大公共卫生问题。小脑是甲状腺激素发挥作用的重要靶器官，是研究碘缺乏致脑发育损伤的良好模型。碘缺乏致甲状腺功能减退可致机体发生精神运动障碍，相应的临床表现与小脑在生长发育过程中的一系列改变直接相关。碘缺乏可损伤神经系统正常的发育过程，甚至造成不可逆的损伤，其分子机制尚不明确。Doublecortin，Reelin，Caveolin-1及Synaptotagmin-Ⅰ在神经系统生长发育过程中都可发挥重要作用。Doublecortin是新生神经元的标志分子，通过调节新生神经元微管的细胞骨架结构及其稳定性，起到促进未成熟神经元迁移和分化的作用；Reelin表达可受甲状腺激素直接调控，参与调节神经元细胞定向迁移，并帮助其完成正常的分化和定位。Caveolin-1广泛分布于中枢神经系统各类神经元细胞中，在细胞迁移中调剂细胞膜的成分和细胞表面的扩张，参与信号分子的极化和细胞骨架的重构；Synaptotagmin-Ⅰ参与突触囊泡的胞吞与胞吐，在神经系统发育过程中参与轴突外向生长过程。碘缺乏致甲状腺功能减退影响大鼠仔鼠小脑发育过程中是否涉及到Doublecortin，Reelin，Caveolin-1及Synaptotagmin-Ⅰ的改变，这几种蛋白的改变规律如何，目前尚不清楚。因此，我们采用碘缺乏饲料和不同剂量的丙基硫尿嘧啶(PTU)饮水建立碘缺乏和甲状腺功能减退动物模型，检测仔鼠小脑细胞凋亡水平，应用免疫组织化学与Western blotting技术检测不同发育阶段仔鼠小脑组织中发育相关蛋白表达的变化规律，探讨碘缺乏致神经系统发育损伤的相关分子机制。
　　 实验方法:
　　 1、实验动物与分组
　　 健康2月龄雌性Wistar大鼠，体重250g-280g。取孕鼠28只，按体重均衡原则随机分为4组，每组7只孕鼠，分组及饮食：碘缺乏组，缺碘饲料+去离子水；5ppm PTU组，普通饲料+5ppm PTU+去离子水；15ppm PTU组，普通饲料+15ppm PTU+去离子水；对照组，普通饲料+去离子水。自妊娠第6天(GD6)起，按照上述方式喂养，直至仔鼠出生后第28天(PND28);此后至PND42，各组均饲以普通饲料，饮用自来水。PND4时，每窝按雌雄数量尽可能相等的原则保留9-10只仔鼠。PND25时断乳、分笼饲养。PND14、PND21、PND28和PND42时，每组随机从不同窝中各抽取8只仔鼠，其中5只仔鼠灌流固定大脑，用于脑组织病理切片和形态学观察；另3只仔鼠剥离小脑组织，用于WesternBlotting测定。
　　 2、仔鼠生长发育状况观察
　　 自PND0起，观察仔鼠生长发育状况，分别于PND14、PND21、PND28和PND42时称取仔鼠体重。在整个实验过程中记录仔鼠行为、体重等常规指标。
　　 3、血清FT3、FT4测定
　　 在PND14、PND21、PND28和PND42，每组分别随机选取8只仔鼠，开胸采血，3000rpm离心5min，取上清。采用固相化学免疫发光法测定血清中游离四碘甲状腺原氨酸(FT4)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)的含量。
　　 4、病理切片制备
　　 各组于PND14、PND21、PND28和PND42分别取5只仔鼠，采血后，剥离并固定小脑，常规石蜡包埋，行冠状位连续切片（6μm），当看到切片包含完整的小脑组织时，每隔5、6张连续切片收集1张，制成石蜡切片。
　　 5、原位末端标记荧光染色（TUNEL染色）
　　 每只仔鼠随机选取3张切片，行TUNEL染色，荧光显微镜下观察小脑皮质神经元细胞凋亡情况，随机选取5个相同视野，每个视野下计数200个神经元细胞，计数阳性染色细胞数，取其平均值。
　　 6、免疫组织化学染色检测Reelin蛋白免疫阳性表达
　　 分别于PND14、PND21和PND28每组取3只仔鼠标本，切片。免疫组织化学染色，观察小脑Reelin蛋白的免疫阳性表达。用图象分析系统及图象分析软件分析小脑Reelin蛋白表达的积分光密度值。
　　 7、Western Blotting检测小脑Doublecortin，Caveolin-1及Synaptotagmin-Ⅰ的表达
　　 每组分别从不同窝中随机选取3只仔鼠，取大脑组织，剥离小脑。采用Western Blotting的方法分别检测Doublecortin，Caveolin-1及Synaptotagmin-Ⅰ的表达水平。
　　 8、统计学处理
　　 采用SPSS11.5建立数据库，进行统计分析。结果表示为Mean±SD。数据分析比较均采用单因素方差分析(ANOVA)。满足方差齐性时，两两比较采用最小显著差值法（Least-significant Difference，LSD）；不满足方差齐性时，两两比较采用Dunnett's T3法。P＜0.05时差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 1、仔鼠生长发育状况对照组子代大鼠体重增加较快，活动性强，对外界刺激反应较为敏感，体毛生长正常；碘缺乏组及PTU处理组（5ppm和15ppm）子代大鼠体重增加慢，体形较小，行动迟缓，反应迟钝，被毛萌出晚且稀疏。对照组仔鼠的体重均显著高于碘缺乏组、5ppm PTU处理组和15ppm PTU处理组，差别有统计学意义(P＜0.05)。
　　 2、大鼠仔鼠激素含量的变化在PND14-PND28期间，碘缺乏组、5ppm PTU处理组和15ppm PTU处理组仔鼠的甲状腺激素含量较对照组明显下降，差别有统计学意义(P＜0.05)，而TSH含量较对照组则反馈性升高。PND42，停止碘缺乏饲料及PTU饮水后，激素水平逐渐恢复(P＞0.05)。
　　 3、碘缺乏与甲状腺功能减退对大鼠仔鼠小脑神经细胞凋亡的影响PND14、PND21时，对照组仔鼠小脑神经细胞凋亡水平略低；与对照组相比，5ppmPTU处理组、碘缺乏组和15ppm PTU处理组凋亡水平依次升高，较对照组有明显差异，差别有统计学意义(P＜0.05)。
　　 PND28，对照组镜下未检测出凋亡阳性细胞。碘缺乏组、5ppm PTU处理组和15ppm PTU处理组神经元细胞凋亡水平仍然处于较高水平(P＜0.05)。
　　 4、碘缺乏与甲状腺功能减退对大鼠仔鼠脑生长发育相关蛋白的影响PND14和PND21，免疫组织化学染色结果显示对照组reelin阳性表达高于实验组，差别有统计学意义(P＜0.05)。PND28，各组表达水平相近，差别无统计学意义(P＞0.05)。Western blotting结果显示，在PND14，Dcx蛋白表达实验组与对照组相比显著降低，差别有统计学意义(P＜0.05)；在PND21和PND28，Dcx表达实验组与对照组相比显著升高，差别有统计学意义(P＜0.05)。PND28和PND42，Caveolin-1表达实验组与对照组相比显著升高，差别有统计学意义(P＜0.05);Synaptotagmin-Ⅰ表达实验组与对照组相比显著降低，差别有统计学意义(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 1.我们证实母体碘缺乏和甲状腺功能减退可造成仔鼠小脑神经元发育障碍；
　　 2.碘缺乏和甲状腺功能减退可引起神经发育相关蛋白表达改变。碘缺乏致大鼠仔鼠小脑发育障碍的分子机制可能涉及Dcx、reelin、caveolin-1、synaptotagmin-Ⅰ等蛋白在小脑发育过程的表达改变。

目录

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英文缩略语

论文 碘缺乏致大鼠仔鼠小脑神经发育障碍及对相关蛋白 Doublecortin、Reelin、Caveolin-1、Synaptotagmin-Ⅰ 表达的影响

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结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 碘缺乏和甲状腺功能减退对神经发育相关蛋白影响的研究进展

参考文献

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