shRNA干扰AuroraA基因表达对喉癌Hep-2细胞增殖与中心体扩增的影响

摘要

中心体作为细胞的主要微管组织中心,在细胞分裂时建立双极纺锤体、执行精确的染色体分离而保持基因组稳定。中心体复制周期的异常会导致单极或多极纺锤体及染色体异倍体形成,后者一直被认为是基因组不稳定和肿瘤发生的原因。现已发现了许多肿瘤细胞中存在多种中心体异常,而中心体扩增是常见的异常之Aurora A基因(又称BTAK/STK15),定位于人类染色体20q13.2,是与中心体异常密切相关的基因之一,在中心粒成熟和纺锤体的形成过程中起重要作用。Aurora A基因在细胞周期G1期不表达或低表达,而在G2/M期其表达量达到峰值。Aurora A过表达导致中心体扩增、形成异常纺锤体,细胞有丝分裂异常,会使染色单体错误分离,导致基因组不稳定,细胞转化进而引发肿瘤。Aurora A基因已被认为是一种判断肿瘤进展与预后的肿瘤标记物。
　　 喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一,其中喉鳞状细胞癌(L,aryngealSquamous Cell Carcinoma,LSCC)是喉癌中最常见的类型。近1O年来,我国喉癌的发病率呈现逐年上升的趋势,地域分布上,东北地区是喉癌的高发区域。喉癌对放疗及化疗均不敏感,手术是目前治疗的主要手段,但手术具有不小的损伤性,术后患者的生存率和生活质量均不理想。此外,在诊断和治疗过程中普遍存在的一个问题是:喉癌的发病比较隐蔽,患者发病就诊时往往多已进入了中、晚期。因此实现对喉癌的早期发现、早期诊断,并在基因水平寻找新的治疗手段成为当前急需解决的问题。基因异常在疾病发生和发展的过程中起着非常重要的作用,很多学者认为进一步解决上述问题可能依赖于新兴的生物治疗。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是目前研究基因功能强有力的方法之一,能够用于研究特定基因的表达抑制,有望对喉癌的基因治疗提供新思路。本研究旨在探讨shRNA干扰Aurora A基因表达对喉癌Hep-2细胞增殖和中心体扩增的影响,探索有效的基因治疗靶基因、寻找理想的标志物,为喉癌的生物学治疗提供新的分子靶点和理论依据。
　　 材料与方法：
　　 1、实验材料:
　　 (1)喉鳞状细胞癌Hep-2细胞系,BALB/c雌性裸鼠,感受态大肠杆菌JM109。
　　 (2)主要分子生物学相关试剂:RPMI1640培养基,胎牛血清,TRIzol,脂质体转染试剂盒,Taq酶,琼脂糖,反转录试剂盒,pGCSilencerTMU6/Neo/GFPvector表达载体,Control-shRNA载体,鼠抗γ微管蛋白单克隆抗体,兔抗β-Actin蛋白单克隆抗体,兔抗Aurora A蛋白单克隆抗体,辣根酶标记山羊抗兔IgG,FITC标记山羊抗鼠Ig(γ,微管蛋白特异性),QIAGEN质粒中量提取试剂盒。
　　 2、实验方法:
　　 (1)利用基因重组技术构建针对Aurora A基因的shRNA表达载体(Aurora A-shRNA)用DNA测序法鉴定重组载体。
　　 (2)用脂质体转染技术将重组质粒Aurora A-shRNA转染Hep-2细胞,同时以转染Control-shRNA载体组作为对照。(分别命名为si组和Control组)
　　 (3)RT—PCR方法检测Hep-2细胞@Aurora A基因的表达,Western blot法检测Hep-2细胞中Aurora A蛋白质的表达,证实干扰效应。
　　 (4)MTT、流式细胞术(Flowcytometry,FCM)分析shRNA干扰Aurora A基因后细胞增殖和细胞周期变化,以探讨Aurora A基因对喉癌细胞生物学特性的影响。
　　 (5)免疫荧光法检测各组细胞转染后中心体扩增情况。
　　 (6)常规染色体制片,对各组细胞进行分裂指数统计分析。
　　 (7)建立裸鼠移植痛模型:15只BABLE/c裸鼠,4～6周,雌性,随机分三组,其中两组注射Hep-2细胞与PBS的混悬液,另外一组注射PBS。喉癌移植瘤模型建立成功后,每3天siRNA组和Control组分别注射Aurora A-shRNA+100ullipofectamine和40μg Control-shRNA载体+100μl lipofectamine,共计5次。观察各组裸鼠瘤体生长变化及检测Aurora A在mRNA和蛋白质水平的表达情况。
　　 实验结果：
　　 1、DNA测序分析表明针对Aurora A基冈的重组载体构建成功。
　　 2、RT-PCR和Western blot狄度比半定量检测结果显示,特异性Aurora A-shRNA转染Hep-2细胞第五天,Aurora A mRNA表达水平较对照组降低了54.89％(p<0.05)；Aurora A蛋白表达水平较对照组降低了61.61％(p<0.05),表明AuroraA表达受到抑制。
　　 3、Aurora A shRNA转染Hep-2细胞第5天对其生物学行为的影响:与对照组相比,实验组喉癌Hep-2细胞的增殖能力显著降低、细胞周期发生G2期阻滞。
　　 4、中心体异常统计结果:Aurora A shRNA转染Hep-2细胞第5天,在检测的5张玻片中中心体数目变化范围为1～8,有中心体异常的细胞(即中心体数目>2)为O～1％明显低于对照组的9～15％(p<0.05)。
　　 5、细胞分裂指数统计结果:实验组的分裂指数为8.2％0,明显低于对照组的31.6‰(p<0.05)。6、体内试验证实干扰Aurora A基因可降低Aurora A基冈的表达,阻滞肿瘤生长。
　　 结论：
　　 1、Aurora A特异性shRNA表达载体转染喉癌Hep2细胞可有效干扰Aurora A基因的表达和Hep-2细胞增殖；细胞分裂指数和中心体扩增受到抑制。
　　 2、体内实验证实干扰Aurora A基因可抑制Hep-2细胞移植瘤生长,使AuroraA基因的表达下调。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略语

论文

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述:Aurora A的肿瘤学研究发展

在学期间科研成绩

致谢

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