体外诱导鲍曼不动杆菌突变耐药与主动外排机制的相关性研究

摘要

前言：
　　 鲍曼不动杆菌是一种革兰氏阴性非发酵菌,广泛分布于自然界及人体皮肤机体免疫力下降时可引起严重感染,如呼吸相关性肺炎(VAP)、败血症、泌尿系感染、脑膜炎等,故成为院内感染的重要病原体。在过去十年,随着现代先进诊疗技术的丌展,抗生素和免疫制剂的临床广泛使用,鲍曼不动杆菌形成单一耐药到多重耐药或全耐药、低耐药率到高耐药率的发展趋势,引起严重致死性院内感染的主要病原菌,抵抗所有常用的革兰阴性抗菌剂,致使临床用药陷入困境,已成为一个重要的全球性问题。因此从诱导多重耐药机制的研究入手寻求解决办法成为一种必然趋势。现有研究表明主动外排机制是促使鲍曼不动杆菌耐药的一个重要因素,adeB基因在介导鲍曼不动杆菌耐药中发挥重要作用,这种编码外排系统基因的高表达导致了鲍曼不动杆菌的高耐药和多重耐药,可致对氨基糖苷类、β-内酰胺类、喹诺酮、四环素、氯霉素、红霉素、溴乙锭等多种药物耐药。故本研究拟通过体外诱导鲍曼不动杆菌突变耐药试验,分析敏感菌株同其诱导耐药菌株间adeB主动外排编码基因表达量的变化差异,验证主动外排机制在鲍曼不动杆菌突变耐药中的意义。
　　 目的：
　　 了解阿米卡星、奈替米星和亚胺培南在体外分别单独诱导鲍曼不动杆菌耐药株的情况;同时分别比较敏感菌株与体外诱导突变稳定耐药菌株间主动外排系统adeB表达量的情况;并观察外排泵抑制剂存在下对敏感菌株及稳定突变耐药菌株耐药水平影响程度的差异,以探讨鲍曼不动杆菌耐药性变化与主动外排系统表达间的关系。
　　 实验材料和方法：
　　 标本来源于2009年1月至2010年12月中国医科大学附属第一医院临床分离的血液或引流物,分别对阿米卡星、奈替米星和亚胺培南敏感的鲍曼不动杆菌(各有19、17和25株),均为非重复菌株(同一病人只收集一株菌)。采用微量肉汤稀释法分别测定对阿米卡星、奈替米星和亚胺培南的最低抑菌浓度(MIC),同时分别用上述三种药物进行体外诱导耐药试验:并观察敏感菌株和耐药株在CCCP存在条件下MIC值的变化程度;予以实时荧光定量ORT-PCR方法测定敏感菌株与诱导耐药后外排泵编码基因adeB表达量的差异。
　　 结果：
　　 筛选的分别对阿米卡星、奈替米星和亚胺培南敏感菌株分别为19、17和25株。由阿米卡星、奈替米星和亚胺培南各自进行体外诱导耐药产生的稳定耐药菌株分别有11、15和8株:全部敏感菌株和亚胺培南突变耐药菌株在含CCCP的条件下MIC值最大降低2倍,呈外排表型阴性,而阿米卡星、奈替米星突变耐药菌株在含CCCP的条件下分别有10、14株MIC值降低4倍或4倍以上,呈明显的外排作用;实时定量QRT-PCR方法结果显示敏感菌株以及亚胺培南突变耐药菌株的adeB外排泵编码基因均阴性,而阿米卡星和奈替米星突变耐药菌株分别有10和5株表达adeB基因。
　　 讨论：
　　 鲍曼不动杆菌形成单一耐药到多重耐药或全耐药、低耐药率到高耐药率的发展趋势,已成为引起严重致死性院内感染的主要病原菌,抵抗所有常用的革兰阴性抗菌剂,已成为一个重要的临床全球问题。
　　 结果显示,鲍曼不动杆菌菌株对不同抗生素的反应是不同的,由于外排泵系统作用。对外排泵抑制剂CCCP与QRT-PCR法结果并不一样,说明外排泵抑制剂并不能完全反映主动外排泵adeB的情况:耐药菌株不仅存在AdeABC外排系统,可能还存在其它外排泵机制的介导,或还存在其他重要的耐药机制,如ESBLs酶、外膜通透性的改变与丢失等,有待后期实验进一步研究。
　　 长时间、不规范应用低于正常杀菌剂量的抗生素容易诱导出细菌的耐药性,也正是细菌耐药最常见的原因之一。本试验通过体外药物诱导证实了鲍曼不动杆菌可在长期低剂量的接触抗菌药物后产生耐药性变异,形成耐药菌证明此点。因此,合理使用抗菌药,加强对耐药菌株的监控检测及治疗,可减少或避免耐药株的传播及暴发流行,也是预防及减少医院条件致病菌感染及耐药性形成传播的重要风险管理对策。
　　 结论：
　　 本试验通过体外药物诱导试验证实了敏感的鲍曼不动杆菌可在长期低剂量的接触抗菌药物后产生耐药性变异,诱导耐药过程中除了主动外排机制的存在还有其它机制的参与,共同加剧了其对临床常用抗菌药物的耐药性。