恶性疟原虫surf家族在红内期转录水平和红细胞胞浆内转运机制及氯喹通过抑制TLR9抵抗脑疟发生的免疫机制的研究

摘要

实验目的：
　　 疟疾是由蚊媒传播的热带地区最常见的寄生原虫感染性疾病。恶性疟原虫是最具致死性和危害性最大的原虫种属。全球每年有3～5亿人感染恶性疟原虫,200多万人死亡。红内期中红细胞表面表达的原虫抗原是介导各种临床症状的病理基础,同时也是宿主保护性免疫系统作用的靶点,如:恶性疟原虫红细胞表面抗原-1(PfEMP1),可介导原虫感染红细胞黏附于微血管壁和未感染红细胞,引发脑疟和胎盘疟疾发生。脑疟(CerebralMalaria,CM)是疟疾感染后最为严重的临床症状,仅撒哈拉南部非洲,每年有100万5岁以下儿童死于恶性疟原虫感染。由于抗药疟原虫和耐杀虫剂蚊的出现,在过去数十年中,开发新型有效的措施以抑制此种感染性疾病已成为全球亟待解决的问题。
　　 近年研究发现一大分子量原虫分泌蛋白家族——恶性疟原虫表面相关散布基因家族(surface-associatedinterspersedgene,surf),表达于感染红细胞表面,可能是介导脑疟发生的恶性疟表面抗原之一。同时,免疫学相关研究表明,前炎症细胞因子的过度释放可介导脑疟发生。FLR9是参与CM发病的重要分子,主要通过在脑组织募集免疫细胞,诱导Freg和/或协同IFN-γ信号来促进CM发生。CQ现在被用作胞内酸化(TLR3、7、8和9活化所必需)抑制剂来治疗自身免疫病。因此,疟疾感染过程中,CQ可能通过TLRs来影响DCs的功能,从而调节固有免疫应答以及随后的适应性免疫应答,为抑制的脑疟发生提供可能。
　　 为此,本研究通过分子生物学和免疫学手段,检测不同原虫株(实验株:3D7A和3D7B,野生株:MS814A1和MS814A5)中.surf家族成员在红内期各阶段的转录水平和转录模式,探讨其作为疟疾感染阻断疫苗候选抗原的可能性。通过构建融合表达SURFIN4.1蛋白的不同区域与Ty和绿色荧光蛋白(Greenfluorescenceprotein,GFP)的表达载体,体外转染恶性疟原虫泰国分离株MS822,通过免疫印迹(WesternBlot)检测融合蛋白表达情况;通过间接免疫荧光(IFA)检测荧光信号定位,从而明确SURFIN4.1在感染红细胞内的定位和介导此蛋白转运的蛋白序列,为进一步的功能分析提供理论依据。并在体内研究了CQ对实验性脑疟模型(Pb.ANKA感染C57BL/6小鼠)中宿主免疫应答的影响。从而为恶性疟的防控和治疗工作提供充实的理论和实验依据。
　　 实验方法：
　　 1、恶性疟原虫体外培养
　　 采用常规方法体外培养恶性疟原虫3D7A,3D7B,MS814A1,MS814A5和MS822株。其中3D7A,3D7B,MS814A1和MS814A5株在Percoll-Sorbitol方法同步化处理后,进行surf家族成员转录水平的检测;MS822株为转染原虫宿主株,经相同方法同步化处理后,在裂殖体期原虫＞5%时,可用于转染。
　　 2、总RNA的提取和反转录获取cDNA
　　 于-80℃冰箱中取出1000μl冷冻的恶性疟原虫TRIzol混合液,室温融化5min,按TRIzolLS试剂使用说明提取总RNA。用紫外分光光度仪检测其吸光度(A260/A280值),检测RNA纯度并计算其浓度。反转录采用随机引物法,按SuperscriptⅢ试剂使用说明操作,获得的cDNA于-20℃保存备用。
　　 3、质粒构建
　　 疟原虫数据库PlasmoDB4.0中surf相关编码基因的获取,RT-PCR标准质粒的制备,SURFIN4.1蛋白编码基因中各功能域相关引物的设计。目的片段采用常规PCR方法扩增,采用凝胶回收提取试剂盒纯化PCR产物后,用于质粒构建。
　　 4、实时荧光定量PCR测定及熔解曲线的分析
　　 实时定量PCR的反应体系为2xPowerSYBRgreen反应混合物12.5μl,cDNA模板2μl,10pmol/μl上、下游引物各0.25μl,三蒸水10μl。反应条件为预热50℃2min;95℃10min;95℃15s,62℃1min;68℃7s;共50个循环。循环结束后进行熔解曲线分析。在同一次反应中设置标准质粒反应组(4个浓度分别1×108、1×107;1×106;1×105;1×104;1×103;1×102;1×10-1;1×10°copies/μl),所有反应设3个重复。用实时定量荧光PCR仪ABI7300软件,根据质粒标准品建立标准曲线,计算待测样品中各基因拷贝数。
　　 5、Gateway技术中pEN克隆和表达载体的构建
　　 本研究中所有转染相关质粒均采用Invitrogen公司的GATEWAYMultisite特异性重组方法进行构建。
　　 6、恶性疟原虫体外转染
　　 采用QiagenMaxi质粒提取试剂盒提取纯化待转质粒,调质粒浓度为1000ng/ul以备转染。收集新鲜的人O型血红细胞,采用ICM培养基,1500rpm5min洗涤3次。充分混合100ul待转质粒(浓度:1000ng/ul)与300ul人O型血红细胞,0.32KV、960uF条件下,应用Bio-RadGenePulserⅡ转染仪(Bio-Rad,Hercules,CA)进行电转。将转染后的红细胞转移至15ml管中,采用5mlICM1500rpm5min洗涤3次后转入5mlCM培养基(Ht:0.25%),加入晚期裂殖体阶段的恶性疟原虫3D7株和野生型MS822株感染红细胞,调原虫血症为0.2%,常规条件下体外培养。上述转染步骤均在冰上操作。转染后第5天加10nMWR99210(疟原虫二氢叶酸还原酶抑制剂)筛选阳性克隆。通常,表达GFP融合蛋白的原虫可在转染后20～35天被检测到,10nMWR99210可保持培养基中转染原虫的阳性率为100%。
　　 7、Site-directedmutagenesis(位点特异性突变)
　　 采用Toyobo的位点特异性突变试剂盒通过使用megaprimer转变检测区域的蛋白序列,以明确介导转运的蛋白功能区。
　　 8、重组蛋白SURFIN4.1-3Ty-GFP的检测
　　 (1)IFA定位重组蛋白
　　 采用丙酮一甲醇或100%甲醇试剂对原虫感染红细胞的薄血膜涂片-20℃下固定10min。采用含5%BSA(牛血清白蛋白)的PBS封闭薄血膜片1小时之后,采用鼠抗-Ty的单克隆抗体(1:500,Diagenode,Mab-054-050)和兔抗-SBP1的多克隆抗体37℃孵育1小时。洗涤两次之后,采用抗鼠Alexa-Fluor488(公司:Invitrogen)和抗兔Alexa-Fluor594(公司:Invitrogen)及DAPI或Hoechst33256(1mgml/1)共孵育后检测。
　　 (2)WesternBlot检测重组蛋白的表达
　　 收集成熟滋养体和裂殖体感染的红细胞,采用含蛋白酶抑制剂的PBS(PBS-PI)通过反复冻融三次的方法提取原虫水溶性蛋白。用PBS-PI洗涤两次后,采用含1%TritonX-100冰上孵育30min,提取膜蛋白;不溶性物质采用1%TritonX-100洗涤两次后,离心弃上清,在沉淀中加入2%SDS,室温孵育30min,进一步提取膜连接蛋白。
　　 100℃孵育3min,待蛋白充分变性后,采用1×SDS-PAGEloadingbuffer溶解样本,5～20%聚丙烯酰胺凝胶(ATTO公司,日本)进行电泳检测。使用Bio-Rad湿式转膜装置和0.22μmPVDF膜(FFP30/FFP33),在15-20mA转膜过夜。10%的BSA封闭PVDF膜后,采用鼠抗-Ty的单克隆抗体(1:500,Diagenode,Mab-054-050)标记待检测蛋白,之后采用辣根过氧化物酶交联的特异性二抗HRP标记的羊抗鼠IgG(Promega;批号:W4021)和ECL检测试剂盒(Millipore)进行检测。
　　 10、实验动物处理、感染及原虫血症观察
　　 CQ处理:C57/BL6小鼠随机分为四组:正常感染组(NC);前3h组(pre-3h);后6h组(pro-6h);后3d组(pro-3d)。实验组分别于感染前3h和感染后6h、3d口服给予CQ(50mg/Kg),对照组在相同的时间点接受相同量的生理盐水。
　　 TLR9抑制剂处理:H154组,在感染前1天腹腔注射H154(3mg/kg);A151对照组,在感染前1天腹腔注射A151(3mg/kg)。
　　 小鼠感染:经腹腔感染1×106Pb.ANKA寄生的红细胞(PRBC),感染不同时间的小鼠经尾静脉采血,制备薄血膜,Gicmsa染色,镜检计数红细胞感染率。
　　 11、脾细胞培养
　　 无菌取出感染0d、3d、5d小鼠脾脏,用10%FCS-RPMI1640培养液制成细胞悬液,1500rpm离心10min,用0.17MN4Cl裂解红细胞,RPMI1640洗涤两次。以含10%FCS-RPMI1640调整脾细胞终浓度为1×107/ml,于24孔培养板上加入细胞悬液,500ml/孔,每组设2个复孔。于37℃培养48h。350g室温离心10min,收集上清,-80℃保存,待IFN-γ、TNF-α和NO2-检测。
　　 12、IFN-γ及TNF-α检测
　　 用双抗体夹心ELISA法对小鼠脾细胞培养上清中的IFN-γ以及TNF-α的含量分别进行检测,酶标仪检测450nm处OD值。应用SoftMaxPro4.3.1LS软件分析,绘制标准品标准曲线,计算细胞因子含量(pg/ml)。
　　 13、NO2-检测
　　 以Griess反应检测脾细胞培养上清中的NO2-含量,100ml上清和Griess反应液100ml室温反应10min,用NaNO2作为标准品,酶标检测仪550nm处检测其OD值。
　　 14、脾细胞样品制备及荧光抗体染色
　　 DCs检测:每份样品用抗CD11c-FITC单抗、抗CD11b-PE单抗、抗CD45R/B220-PerCP单抗和抗MHCⅡ-APC单抗进行四色分析,另设阴性对照管,在预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1ml,再加入抗CD11c-FITC单抗、抗CD11b-PE单抗和抗CD45R/B220-PerCP单抗进行表面染色,离心去上清后,用0.5mlPBS重悬浮细胞,流式细胞仪进行检测。TLR9检测:每份样品应用FITC标记的抗小鼠CD11c单抗和Biotin标记的抗小鼠TLR9单抗进行双色分析,另设单标CD11c单抗和TLR9单抗对照管。每管预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体2ml。然后用抗CD11c-FITC单抗进行表面染色,振荡器低速混匀,冰浴放置,避光反应30min。每管加入2ml含2%FCS的PBS,1500rpm离心5min,弃上清,洗涤两次。然后加入固定透膜夜250μl,4℃孵育1h。再加2ml1×wash固定透膜洗液,1500rpm离心5min洗涤1次,弃上清。每管加100ul含2%FCS的PBS重悬细胞。加入抗-TLR9-BiotinmAb进行胞内标记,4℃孵育30min。每管加入2ml含2%FCS的PBS,1500rpm离心5min,弃上清,洗涤两次。加入抗-Streptavidin-PE进行胞内标记,4℃孵育30min。每管加入2ml含2%FCS的PBS,1500rpm离心5min,弃上清,洗涤两次。每管加入500μl2%多聚甲醛固定液重悬,静置15min,上机。
　　 15、统计学处理
　　 应用SPSS11.5统计学分析软件。单因素方差分析比较各组均值的显著性差异。P小于0.05为差异显著。
　　 实验结果：
　　 1、荧光定量RT-PCR实验结果的分析
　　 结果显示,在3D7A,3D7B和MS814A5中surf基因各成员在环状体期高度表达,在滋养体期表达水平显著下降,而在裂殖体期转录水平再度升高。其中,3D7A和3D7B中各不同时间点,surf基因家族中surf4.1和surf13.1转录水平明显高于其它家族成员。不同于surf4.1在环状体和裂殖体期高度转录表达的特点,surf13.1的高度转录表达主要在环状体期原虫,提示其在恶性疟原虫感染红细胞早期,胞内环境的建立过程中发挥重要作用。在MS814A1和MS814A5样本中,同样可在裂殖体期检测到surf4.1基因不同于其它surf基因的高度转录表达,且其转录水平显著高于裂殖体期原虫主要抗原PfAMA1。Sutf4.1在裂殖体期的高度表达,提示此基因编码的蛋白SURFIN4.1在疟原虫裂殖子侵袭过程中可能发挥重要作用。
　　 2、SURFIN4.1蛋白在3D7株中新发现的编码序列和蛋白序列
　　 本研究中,通过检测基因组DNA(gDNA)和cDNA中SURFIN4.1的编码序列,我们发现,PlasmoDB数据库中结果有误。在3D7株中,SURFIN4.1的第一个内含子序列内部,核苷酸位点2371.2589bp: