病毒载体携带自杀基因Dm-dNK(果蝇脱氧核糖核苷酸激酶)对实体肿瘤双重分子靶向治疗的研究

摘要

目的：
　　 自杀基因辅以前药治疗(genedirectedenzymeprodrugtherapy,GDEPT)在近20年的研究中取得较大成绩。广泛应用的基因治疗系统为单纯疱疹病毒1型胸腺嘧啶激酶/戊环鸟苷(HSV-TK/GCV)系统。HSV-TK有着很高的催化效率,但HSV-TK/GCV得杀伤机制还未完全明确,而且HSV-TK/GCV系统用于自杀基因辅以前药治疗的主要缺点在于当其杀伤靶细胞后,有毒性的三磷酸化物GCV-TP会杀伤临近细胞。自杀基因辅以前药治疗综合了分子治疗,酶激活前药治疗,基因前药治疗,是基因治疗的巨大进步,同时需要增强对前药毒性的进一步控制。虽然在基础实验的治疗效果被肯定,但自杀基因在临床上的应用有着杀伤效率有限及使用安全性问题。
　　 果蝇多底物脱氧核苷酸激酶基因(multisubstratedeoxyribonucleosidekinaseofDrosophilamelanogaster,Dm-dNK)能够催化自然界所有嘌呤嘧啶脱氧核糖核酸的磷酸化反应,除了其广泛的底物特异性,这种激酶还表现出惊人的催化效率.要高出我们所曾了解的核酸激酶效率的10-100倍。在最近的实验中,研究者试着使Dm-dNK在癌细胞种系中表达来起到一种自杀基因的作用,试验成功证明这种酶在癌细胞表达的可能性以及其在癌细胞中酶活性的保持,不仅如此Dm-dNK还增加了癌细胞对某些化疗药物的敏感性。
　　 选择复制性腺病毒(Conditionallyreplicatingadenoviruscs,CRAds),也称为溶瘤腺病毒,它为恶性肿瘤的治疗提供了一个新的平台。选择复制性腺病毒不但只感染肿瘤细胞并杀死它们,而且对正常细胞没有杀伤效果。对实体肿瘤同样效果明显。选择复制性腺病毒克服了传统基因治疗的缺点,包括感染率低,没有特异性,杀伤效果差等。在放疗,化疗等传统治疗无能为力时,CRAds更好的诠释了其自身的特点。然而,CRAds的复制有时难以控制,从而导致它在正常细胞中的复制并发生了副反应。这就急需提高它的安全性及可控性。
　　 我们构建了新的病毒载体携带Dm-DNK,进一步我们在体外,体内试验中检测Dm-DNK的抗肿瘤特性。
　　 方法：
　　 一、细胞培养
　　 肿瘤细胞系购买于上海细胞库,正常细胞购买于ATCC.细胞使用L-15培养基或高糖DMEM培养。培养基中含有10%的血清,双抗。培养环境为37℃,5%CO2.
　　 二、Westernblot检测蛋白表达
　　 细胞均匀铺于6孔板(5×105cells/well),24小时后,给予病毒及前药处理。48小时后,提取蛋白液。
　　 取1m110%分离胶溶液,加5ulTEMED后混匀,加入玻璃板内底部聚合封口;将槽内多余液体倒去,水洗3次,剩余9m1分离胶溶液加5ulTEMED混匀,注入玻璃板内,加水覆盖;聚合完成后倒掉水覆盖物,以10%的积层胶4ml,加入5ulTEMED混匀,注入分离胶上端:插入加样梳,将凝胶玻璃板放入电泳槽,聚合5-6分钟,缓慢拔去加样梳,水洗加样孔;将样品和SDS加样缓冲液等比混合,100℃加热3分钟使蛋白变性,按顺序加样;50V电泳,至染料抵达分离胶与积层胶交界处;100V电泳,至染料抵达分离胶底部;将硝酸纤维薄膜漂浮于转移缓冲液,借毛细作用湿润,做好标记;将3MM滤纸浸泡于转移缓冲液,取下凝胶置于硝酸纤维薄膜上,再置于6张3MM滤纸中间,400mA,电转移30分钟至硝酸纤维薄膜上:丽春红S染液染色2分钟,观察转膜情况,去离子水清洗,1xTBST平衡3次,每次5分钟;封闭液封闭1小时,1xTBST洗膜3次,每次5分钟;加I抗反应,室温1小时,1xTBST洗膜3次,每次5分钟;加2抗,室温反应1小时,1xTBST洗膜三次,每次5分钟;加入显色液,每张膜上均匀铺800ul,作HRP发光反应反应2分钟。将膜倒置,贴于保鲜膜上,折叠,封好,贴于增感屏。在暗室中压片,曝光于X-光片(Kodak公司),分别曝光30s-5min。
　　 三、酶活性检测
　　 蛋白提取液用放射性[3H]标记作为底物的核苷酸药物,混合液在WhatmanDE-81滤纸上反应不同时间后经液闪测量仪测定放射活性。
　　 四、CPE实验检测细胞杀伤
　　 取对数生长期的肿瘤细胞及正常细胞,接种于24孔培养板中,24h细胞贴壁后,吸去上清,按MOI=0,0.1,1,10,100加入病毒,设实验组及对照组。37℃,5%C02孵箱培养4h后洗去病毒液,每孔加1ml培养液继续培养。48h后于倒置显微镜下观察、拍照。
　　 五、流式细胞术检测细胞凋亡
　　 (1)对数生长期的细胞计数铺板,按合适密度铺板,分别感染病毒,同时设立阴性对照,37℃,5%CO2孵箱培养4h后洗去病毒液,每组加入培养液继续培养。感染后24h加入前药或PBS感染后48h结束实验。
　　 (2)Annexin-V-FITC染色
　　 根据AnnexinV-FITC/PI试剂使用说明调整细胞为106个/ml,离心弃上清,加入10μlAnnexinV-FITC和5μlPI,轻摇匀,室温避光反应15min,1h内流式细胞仪检测,各组细胞用流式细胞计量仪分别进行检测。
　　 六、细胞杀伤实验
　　 细胞按照一定密度铺于96孔板,培养24小时后,给予病毒及前药处理,48小时后,加入MTT(5mg/ml)20μl/孔,孵育4h后小心吸弃孔内上清液,加入DMSO100μ1/孔,振荡10min,酶标仪测定光密度值(OD570),取3孔平均值记录结果。R450型酶标仪测570nm处光吸收值(OD570nm)。以不感染病毒细胞的OD570nm为标准,其他孔的OD570nm与其相比即为该孔的细胞存活百分数,而细胞杀伤率(%)=1-细胞存活百分数。
　　 七、裸鼠移植瘤实验
　　 若干只Balb/c裸小鼠,右侧腋下接种生长良好的肿瘤细胞悬液。待长出150-200mm3的肿瘤后,随机分为治疗组及对照组,隔天注射1次,注射10天后,腹腔注射前药;对照组,腹腔注射PBS共注射10次。观察裸鼠生存及肿瘤大小,用游标卡尺测量肿瘤短径(a)、长径(b),按公式V=ab2/2计算肿瘤体积,按下式计算抑瘤率:抑瘤率=[(对照组肿瘤的平均体积.实验组肿瘤的平均体积)/对照组肿瘤的平均体积]×100%
　　 结果：
　　 肿瘤细胞感染Dm-dNK后保持其酶活性。
　　 在肿瘤细胞中自杀基因和Dm-dNK联合效应杀伤肿瘤细胞的效果较单自杀基因杀伤肿瘤细胞效果明显。
　　 感染Dm-dNK的正常细胞对照可以观察到极低的酶活性,强烈的联合杀伤效果只在肿瘤细胞中可以观察到。
　　 在动物实验中同样观察到细胞实验中的杀伤效果。
　　 结论：
　　 病毒载体携带Dm-dNK感染肿瘤细胞后表达其酶活性并磷酸化核苷酸类似物,将Dm-dNK运用于基因治疗治疗肿瘤是有希望并且安全的。