Annexin A1介导小细胞肺癌细胞跨脑内皮细胞迁移入脑的作用机制研究

摘要

背景:
　　 流行病学调查表明,在各种脑转移肿瘤中以肺癌脑转移居多,其中病理组织类型为小细胞型的肺癌约占全部肺癌脑转移病例的1/2。小细胞肺癌恶性度高,在疾病的早期就具有向脑组织转移的倾向,因此探讨小细胞肺癌脑转移的分子机制对于小细胞肺癌的防治具有重要的意义。
　　 与其他部位的肿瘤转移机制不同,发生脑转移的前提条件是肿瘤细胞需要通过具有特殊解剖结构的脑部微血管系统——血脑屏障。血脑屏障的破坏多发生在疾病的晚期,然而小细胞肺癌多在疾病的早期,甚至是无法在临床上找到肺部的原发病灶时,就表现出对脑的特异性“亲嗜”能力,这说明小细胞肺癌脑转移具有其自身病理机制的特殊性,但确切的原因尚不清楚。
　　 我们将来源于人脑转移病灶的SCLC细胞株NCI-H250与人脑微血管内皮细胞共培养,利用IlluminaBeadchip表达谱基因芯片筛选了共培养前后NCI-H250细胞中的差异表达基因,由此获得一个差异表达基因——AnnexinA1。
　　 AnnexinA1是Annexins超家族一员,其磷酸化水平的改变影响其生物学功能,具有一个能够独立承担功能的N端结构域,形成的衍生肽段Ac2-26具有和AnnexinA1相似的生物学功能。AnnexinA1在各种肿瘤中表达存在差异,与一些恶性肿瘤的转移相关:AnnexinA1通过激活TGF-β/Smad信号通路使乳腺癌细胞骨架重排,从而使肿瘤细胞发生上皮细胞间质转型(EMT)增强肿瘤细胞转移能力;AnnexinA1可能以自分泌/旁分泌的方式通过激活甲酰基肽受体(FPR)来增强消化道肿瘤细胞迁移能力。但是AnnexinA1是否参与小细胞肺癌病理发生过程,尚未将报道。
　　 本研究拟探讨AnnexinA1在小细胞肺癌细胞穿过血脑屏障转移入脑过程中的作用及可能机制。
　　 方法:
　　 1、收集临床小细胞肺癌原位癌组织和小细胞肺癌脑转移癌组织,利用免疫组织化学(SP染色)以及westernblot检测AnnexinA1在正常肺组织,小细胞肺癌组织以及小细胞肺癌脑转移组织中的表达情况。
　　 2、收集临床小细胞肺癌患者未发生脑转移患者血清和小细胞肺癌发生脑转移患者血清标本,以正常人群为对照,利用ELISA方法检测血清标本中的AnnexinA1的含量。
　　 3、利用Real-timePCR以及westernblot检测与HBMEC共培养前后NCI-H446细胞中AnnexinA1表达变化情况。
　　 4、利用SubcellularProteomeExtractionKit抽提与HBMEC共培养前后NCI-H446细胞中细胞质,细胞膜及细胞核蛋白组分,利用免疫沉淀的方法检测不同蛋白组分中AnnexinA1含量变化的情况。
　　 5、收集NCI-H446与HBMEC共培养前后的培养上清液,利用Westernblot检测培养上清液中的AnnexinA1含量变化情况。
　　 6、用AnnexinA1中和抗体及AnnexinA1衍生肽Ac2-26处理NCI-H446细胞,利用Transwell观察上述处理条件下NCI-H446细胞跨人脑微血管内皮细胞迁移能力变化情况。
　　 7、用AnnexinA1中和抗体及AnnexinA1衍生肽Ac2-26处理NCI-H446细胞,利用细胞粘附实验观察上述处理条件下NCI-H446细胞粘附人脑微血管内皮细胞单层能力变化的情况。
　　 8、构建稳定高表达AnnexinA1的NCI-H446细胞株,利用Transwell观察高表达AnnexinA1的NCI-H446细胞跨人脑微血管内皮细胞单层迁移及粘附人脑微血管内皮细胞单层能力变化情况。同时,利用MTT实验分析高表达AnnexinA1的NCI-H446细胞的细胞增殖能力是否有改变。利用划痕实验分析高表达AnnexinA1的NCI-H446细胞的细胞迁移能力是否有改变。
　　 结果:
　　 1、临床研究表明,发生脑转移的小细胞肺癌患者的脑转移癌组织中AnnexinA1的表达水平明显高于正常肺组织及原位小细胞肺癌组织;同时,发生脑转移的小细胞肺癌患者组血清中AnnexinA1的含量也高于正常人群组和无脑转移发生的小细胞肺癌患者组。
　　 2、NCI-H446细胞与}tBMEC共培养后,NCI-H446细胞中AnnexinA1的mRNA表达明显升高,但蛋白质的水平无明显改变,并且在不同的细胞组分(细胞质,细胞膜以及细胞核)中其表达水平也无明显的变化,说明AnnexinA1在细胞内没有发生蛋白质移位;收集NCI-H446细胞与HBMEC共培养后的培养上清液,利用westernblot检测上清液中AnnexinA1含量明显升高,提示NCI-446细胞与人脑微血管内皮细胞单层相互作用后细胞内AnnexinA1的表达增加,并且被外分泌到细胞外。
　　 3、AnnexinA1中和抗体可以抑制NCI-H446细胞跨人脑微血管内皮细胞单层迁移的能力,而AnnexinA1的衍生肽Ac2-26可以增强NCI-H446细胞跨人脑微血管内皮细胞单层迁移的能力。
　　 4、AnnexinA1中和抗体明显减少了NCI-H446细胞粘附于人脑微血管内皮细胞单层的数量,而AnnexinA1的衍生肽Ac2-26则可以明显增加NCI-H446细胞粘附于人脑微血管内皮细胞单层的数量。
　　 5、构建稳定高表达AnnexinA1的NCI-H446细胞株,发现高表达AnnexinA1的NCI-H446细胞的跨人脑微血管内皮细胞单层迁移能力及粘附人脑微血管内皮细胞单层的能力明显增强,但是细胞的增殖和迁移能力并没有明显变化。
　　 结论:
　　 在小细胞肺癌细胞与脑微血管内皮细胞相互作用的过程中,小细胞肺癌细胞中AnnexinA1表达水平上调,并且可以被外分泌到细胞外,从而促进了肿瘤细胞与脑内皮细胞间的粘附,介导了小细胞肺癌细胞跨脑内皮细胞的迁移。