P0和VEGF在大鼠坐骨神经再生中的表达

摘要

P0蛋白是施万细胞膜上的一种跨膜蛋白，分子量约28KD，主要分布于周围神经髓鞘中，占蛋白总量的50％以上，对维持周围神经髓鞘正常的结构和功能有十分重要的意义。周围神经受损后，施万细胞再生，促进髓鞘形成过程中，P0蛋白水平会发生显著变化，通过对P0蛋白的检测，可以预见受损神经的恢复程度。以往发现P0蛋白具有促进神经细胞生长的作用，但更多是在轴突受损或变性后的再生过程中。体外研究发现，神经细胞再生时，可以检测到P0蛋白及其转录产物的表达。
　　 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在机体内是最主要的促使血管生成的生长因子，其功能是刺激血管内皮细胞生长，启动血管形成和增加血管通透性，并能与内皮细胞表面的特异性受体结合，强烈的促进血管内皮细胞增殖，诱导血管生成，在胚胎发育、创伤修复、侧支循环建立等病理生理过程中发挥重要作用。但VEGF在很多正常以及病理的人或动物体内的表达水平低，无法形成有效浓度，而且VEGF蛋白的生物半衰期非常短，仅为5-6分钟，如果将VEGF蛋白直接应用于损伤处会被周围组织中的酶类很快降解，不能持续发挥作用。转染了VEGF基因的干细胞能使细胞获得局部持续、稳定、高效表达VEGF蛋白的能力，从而从多个方面加强了转基因干细胞对缺血性疾病的疗效:①VEGF可以扩张血管，血供的改善能提高移植细胞的成活率并为其以后的长期增殖分化提供一个良好的生存境;②移植细胞存活数量增多，因为通过对移植细胞的基因修饰可提高其移植后的存活率;③VEGF可诱导干细胞向血管内皮细胞转化。
　　 干细胞疗法、基因疗法用于组织、器官修复是目前研究的热门课题。许多学者通过提取动物不同部位的干细胞进行培养、增殖，然后修复受损器官，获得满意的疗效。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，在不同的诱导条件下可向骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肌细胞和内皮细胞等各种细胞系转化，由于骨髓间充质于细胞属未分化的前体干细胞，表型分化尚不成熟，免疫原性小，所以移植后无排斥反应或反应较弱，而且，骨髓间充质干细胞还具有取材方便、体外扩增容易、体外增殖能力强、易于基因操作等独特的优点，逐渐成为基因治疗适宜的细胞载体。
　　 电刺激疗法(electrical stimulation，ES)应用于促进周围神经再生，有学者认为远端负极电流有促进神经再生的作用，神经生长因子(NGF)及受体等物质在电场中被极化后，向阴极移动，特别是NGF，由于其本身带有较强的正电荷，这些物质在阴极的聚集刺激了神经纤维的生长;电流促进了施万细胞的增殖与迁移，从而诱导神经纤维的生长;电刺激增加损伤处的血液灌注，改善轴浆流动，减少Ca2+内流及其带来的影响，还能提高再生轴突通过瘢痕组织的能力，促进施万细胞增殖及髓鞘再形成。但也有学者表示电刺激阻碍神经再生，造成更重的损伤，不适合临床应用。
　　 本实验采用大鼠坐骨神经夹闭伤为模型，研究P0蛋白在电刺激促进神经再生中的表达情况，以及VEGF基因转染骨髓间充质干细胞疗法对神经修复的影响及其表达情况，为临床治疗周围神经损伤提供实验依据。
　　 实验方法：
　　 论文一:采用体重200g的Wistar大鼠54只，用无齿动脉夹夹闭右侧坐骨神经3分钟，做成神经损伤模型，然后随机分成3组:电刺激组，无电刺激组，正常对照组。术后4周，足迹实验检测运动功能的恢复情况，神经电生理评估复合神经肌肉动作电位的传导速度和波幅变化，光镜和透射电镜观察再生神经髓鞘的变化，Western-blotting检测神经髓鞘P0蛋白变化，RT-PCR检测P0 mRNA的变化。
　　 论文二:采用体重200g的Wistar大鼠36只，用无齿动脉夹夹闭右侧坐骨神经3分钟，做成神经损伤模型，然后随机分成3组:损伤组，BMSCs治疗组，VEGF转染BMSCs治疗组。术后3周，应用HE染色技术检测大鼠再生坐骨神经周围血管形成的变化，光镜和透射电镜观察再生神经轴突，RT-PCR检测各组VEGF mRNA表达变化，Western-blotting检测VEGF蛋白表达的变化。
　　 实验结果：
　　 一、电刺激对大鼠坐骨神经再生的影响及P0在髓鞘的表达
　　 1、大鼠运动功能的恢复
　　 术后每周进行足迹实验，得出坐骨神经功能指数(SFI)，评估神经运动功能的恢复情况。通过对SFI数值变化做出趋势图，从趋势上我们发现电刺激组大鼠的SFI明显好于无电刺激组，统计分析有差异，p＜0.1。
　　 2、神经电生理改变
　　 术后4周，对三组大鼠坐骨神经进行电生理检测，发现电刺激组大鼠的复合神经肌肉动作电位的传导速度要明显快于无电刺激组，统计分析有显著差异，p＜0.05，而波幅的变化无显著性差异，p＞0.05。
　　 3、电刺激对胫骨前肌湿重的影响
　　 术后4周，对三组大鼠术侧和健侧胫骨前肌湿重测量，进行比较，统计结果显示，电刺激治疗组大鼠胫骨前肌湿重大于无电刺激组，p＜0.05。
　　 4、电刺激对再生神经髓鞘的影响
　　 术后4周，再生的坐骨神经段，横切面行甲苯胺蓝染色，光镜下观察可见电刺激组神经的髓鞘完整，增厚，用图像分析软件分析髓鞘厚度，进行各组比较，电刺激组的神经髓鞘的厚度与无电刺激组比较，有显著性差异，p＜0.05。轴索的直径也进行比较，无显著差异，P＞0.05。透射电镜观察，电刺激组神经髓鞘比无电刺激组的髓鞘增厚。
　　 5、再生神经髓鞘P0 mRNA水平的表达
　　 RT-PCR检测再生神经段P0 mRNA表达情况，电刺激组再生神经髓鞘P0 mRNA表达水平上调，高于无电刺激组，统计分析有显著差异，p＜0.05。
　　 6、再生神经髓鞘P0蛋白水平的表达
　　 电刺激组再生神经髓鞘P0蛋白水平增高，与无电刺激组相比有显著性差异，p＜0.05。
　　 二、VEGF转染大鼠BMSCs对再生神经的影响及其表达
　　 1、再生神经周围新生血管的形态学观察
　　 再生神经横断面HE染色可见再生神经周围有新生的毛细血管。VEGF基因转染BMSCs修复组，可见血管数量增多，官腔直径较大，管壁增厚。
　　 2、再生神经轴突形态学观察
　　 光镜和透射电镜观察再生神经横断面，可见VEGF转染组的神经髓鞘较厚，排列整齐，恢复较好。
　　 3、VEGF mRNA在再生神经中的表达
　　 RT-PCR结果表明，无VEGF转染组，VEGF mRNA的仅少量表达，但在VEGF转染组VEGF mRNA的表达明显增加。统计分析，两组比较有显著差异，p＜0.05。
　　 4、VEGF蛋白在再生神经中的表达
　　 Western blotting结果表明转染组再生神经中VEGF蛋白表达增多，与对照组相比有显著性差异，p＜0.05。
　　 结论：
　　 1、P0 mRNA和P0蛋白在电刺激修复周围神经中表达增加。
　　 2、电刺激可以增厚再生神经髓鞘，加快传导速度，促进新生神经运动功能恢复。
　　 3、VEGF基因转染BMSCs修复神经损伤，VEGF mRNA和VEGF蛋白的表达增加，新生血管数量增多、管径增厚。促进神经再生。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 电刺激对大鼠坐骨神经再生的影响及PO在髓鞘的表达

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

论文二 VEGF转染大鼠BMSCs对再生神经的影响及其表达

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述

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