RhoA/ROCK信号通路参与酒精诱导肠上皮细胞屏障通透性增加的机制研究

摘要

目的：
　　 肠粘膜屏障是机体重要的免疫防御屏障，将机体与肠道内的外源性物质隔离开，避免病原微生物侵袭和抗原分子对机体的损伤。肠粘膜屏障包括上皮屏障、免疫屏障和微生物屏障，其中肠上皮屏障是最重要的一道屏障，是肠粘膜具有选择性通透的基础。近年来，大量的研究提示酒精可致肠道损伤、肠通透性增加，导致内毒素肠渗漏。因此，酒精所致肠道通透性改变的分子机制备受关注。
　　 酒精可通过多个环节破坏肠上皮细胞屏障功能，引起屏障通透性增高，但其具体作用环节十分复杂。乙醇可能通过激活诱生型一氧化氮合成酶(iNOS)，使NO过度产生，诱导氧化应激和氧化微管蛋白，从而损害微管细胞骨架;酒精及其代谢产物乙醛亦可以通过抑制磷酸酪氨酸磷酸酶的活性，诱导细胞间紧密连接蛋白的重新分布;乙醇可通过改变细胞膜脂质与脂蛋白比例而增加了细胞膜的流动性，导致细胞对大分子物质的通透性增加;乙醇可激活肌球蛋白轻链激酶(myosinlight-chain kinase，MLCK)，进而改变肌动蛋白和微管等细胞骨架结构，导致肠上皮细胞屏障功能紊乱。RhoA/ROCK信号通路可通过磷酸化肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)，引起紧密连接相关蛋白occludin、ZO-1重分布，紧密连接(tight junction，TJ)开放。且紧密连接作为细胞间通路最主要的屏障直接影响肠粘膜屏障的通透性。我们应用Caco-2细胞株建立体外肠上皮细胞屏障模型，观察乙醇对肠上皮细胞屏障通透性增加和肠上皮细胞间紧密连接的影响，同时探讨RhoA/ROCK信号通路是否参加酒精诱导肠粘膜屏障通透性增加的过程。
　　 方法：
　　 1、应用MTT比色法及LDH法检测乙醇对细胞生长抑制率的影响。
　　 2、体外肠上皮细胞屏障模型的建立，应用Millicell-ERS电阻测量系统检测乙醇作用前后体外跨上皮细胞电阻值(transepithelial electrical resistance，TEER)的变化;应用荧光黄透过率实验来检测乙醇对体外肠上皮细胞屏障通透性的影响。
　　 3、乙醇作用前后及shRNA沉默RhoA基因进行预处理，应用pulldown试剂盒检测RhoA活性形式RhoA-GTP的表达变化;应用Western blot法检测体外肠上皮细胞紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1的蛋白质表达水平;检测磷酸化的肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)和MLC的表达。应用免疫荧光法检测乙醇作用前后及shRNA干扰RhoA基因后紧密连接跨膜蛋白occludin的分布。
　　 4、予以Rho激酶(Rho associated kinase，ROCK)特异性抑制剂Y-27632预处理体外肠上皮细胞屏障模型，检测乙醇作用前后及抑制剂预处理后TEER值及荧光黄透过率;应用Western blot法检测体外肠上皮细胞紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1的蛋白质表达水平;检测磷酸化的肌球蛋白轻链(myosin lightchain，MLC)和MLC的表达。应用免疫荧光染色检测乙醇作用前后及ROCK特异性抑制剂Y-27632预处理后紧密连接跨膜蛋白occludin的分布。
　　 结果：
　　 1、成功建立了体外肠上皮细胞屏障模型。
　　 2、MTT比色法检测结果证实，乙醇浓度≤5％（体积比）时，Caco-2细胞对照组与乙醇作用后刺激因素组生长抑制率无显著差异;乙醇浓度＞5％时，Caco-2细胞对照组与乙醇作用后刺激因素组生长抑制率存在显著差异，具有统计学意义。LDH法检测证实，乙醇浓度≤10％时，Caco-2细胞对照组与乙醇作用后刺激因素组无显著差异。因此我们选择≤5％乙醇浓度进行后续试验。
　　 3、乙醇作用后，体外肠上皮细胞屏障模型的TEER值呈浓度-时间依赖性，随作用时间逐渐降低，于60min时达最低值，此后逐渐恢复，5％浓度乙醇作用尤为显著;荧光黄透过率呈浓度-时间依赖性，随作用时间逐渐增加，于60min时达峰值，此后逐渐恢复，5％浓度乙醇作用尤为显著。予Y-27632预处理使TEER值显著升高，荧光黄透过率显著降低。
　　 4、乙醇作用后，肠上皮细胞的RhoA活性显著升高。予RhoA shRNA干扰后，RhoA的活性显著降低;相应地，乙醇作用后，肠上皮细胞中的P-MLC表达显著升高，予RhoA shRNA干扰后，p-MLC表达显著降低;乙醇作用后，肠上皮细胞紧密连接相关蛋白occludin的可溶性片段(S)与非可溶性片段(IS) IDV比值显著升高，ZO-1的蛋白表达显著降低。荧光显微镜下观察发现紧密连接断裂、消失。予RhoA shRNA干扰后，肠上皮细胞紧密连接相关蛋白occludin的可溶性片段(S)与非可溶性片段(IS) IDV比值显著降低，ZO-1的蛋白表达明显增加。荧光显微镜下观察发现紧密连接跨膜蛋白occludin表达可部分恢复。
　　 5、乙醇作用后，肠上皮细胞中的p-MLC表达显著升高，予ROCK特异性抑制剂Y-27632预处理后，p-MLC表达显著降低;乙醇作用后，肠上皮细胞紧密连接相关蛋白occludin的可溶性片段(S)与非可溶性片段(IS) IDV比值显著升高，ZO-1的蛋白表达显著降低。荧光显微镜下观察发现紧密连接断裂、消失。予ROCK特异性抑制剂Y-27632预处理后，肠上皮细胞紧密连接相关蛋白occludin的可溶性片段(S)与非可溶性片段(IS) IDV比值显著降低，ZO-1的蛋白表达显著增加。荧光显微镜下观察发现紧密连接跨膜蛋白occludin可部分恢复。
　　 结论：
　　 1、RhoA/ROCK信号途径参与乙醇诱导的肠上皮细胞屏障通透性增加的调节过程。
　　 2、MLC参与乙醇诱导的肠上皮细胞屏障通透性增加的调节过程，且为RhoA/ROCK下游信号分子。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一：shRNA沉默RhoA对RhoA/ROCK信号通路在酒精致肠粘膜屏障功能障碍中的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二：ROCK特异性抑制剂Y-27632对Rho/ROCK信号通路在酒精致肠粘膜屏障功能障碍中的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述

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致谢

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