锌缺乏通过线粒体途径诱导MC3T3-E1细胞凋亡的研究

摘要

目的：
　　 骨质疏松症是指单位体积骨量减少伴有骨强度的降低,在目前世界的常见病、多发病中居第7位。骨质疏松所导致的骨折等并发症可导致残疾、死亡,治疗耗资大,给患者、家庭和社会带来沉重的负担。锌作为人与动物生长过程中的一个必不可少的微量营养元素,在骨骼的生长、发育和维持正常骨量中都起到了重要的作用,锌缺乏是导致骨质疏松的重要因素之一。骨质疏松主要与骨形成和骨吸收的动态平衡破坏相关。其中成骨细胞的数量和活性决定了骨形成水平,从而影响骨量。凋亡作为细胞生理、病理的最终阶段,成骨细胞的凋亡在骨质疏松当中起到了重要的作用。本实验通过检测线粒体相关凋亡途径,探讨锌缺乏时成骨细胞凋亡的机制。
　　 方法：
　　 常规培养和传代鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞,取对数生长期的细胞,锌离子螯合剂TPEN制造锌缺乏模型,MTT法检测细胞增殖,并确立合适的TPEN浓度。实验分为四组:正常组:细胞正常培养不加处理因素;TPEN组:培养基中加入终浓度味5μM的TPEN,不加锌离子;锌缺乏组:培养基中加入终浓度5μM的TPEN和1μM的锌离子;锌充足组:培养基中加入终浓度5μM的TPEN和15μM的锌离子。培养24小时后,AnnexinV-FITC/PI流式检测成骨细胞凋亡,JC-1流式检测线粒体膜电位,提取线粒体蛋白,Westernblot检测线粒体中Bax蛋白表达水平,以及细胞质中AIF、cytochromec、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达水平,免疫荧光检测细胞内AIF和cytochromec的线粒体释放。采用SPSS17.1统汁学软件进行统计学分析。数据采用-x±s表示,多组间差异显著性选用单因素方差分析多组间比较,组间比较选用SNK方法,P＜0.05表明具有统计学意义。
　　 结果：
　　 TPEN对MC3T3-E1的增殖有明显的抑制作用,并呈剂量效应关系,24和48h的IC50分别为3.32μM和2.18μM。与正常组和锌充足组相比,TPEN组和锌缺乏组,细胞凋亡明显增加,线粒体膜电位显著降低,线粒体内Bax蛋白表达增加,细胞质中AIF和cytochromec表达增加,AIF和cytochromec由线粒体释放到细胞质中,剪切后的Caspase-9、Caspase-3蛋白表达增加。而正常组和锌充足组、TPEN组和锌缺乏组无明显差异。
　　 结论：
　　 锌缺乏可以引起Bax线粒体易位,从而降低线粒体膜电位,通过Caspase依赖性和Caspase非依赖性线粒体凋亡途径诱导成骨细胞凋亡。