单增李斯特菌及溶血素O与葡萄球菌三种肠毒素免疫胶体金检测技术研究

摘要

本文首先根据NCBI检索李斯特菌溶血素O(hly)序列(登录号：[gi：134116121])，设计引物，常规PCR扩增，并将其产物直接与pMD18-T载体连接，构建克隆测序质粒pMD18-T-hly，进行序列分析鉴定。结果表明，PCR合成的hly基因序列与检索到的向hly基因序列完全一致。然后用BamH I和Xhol I分别双酶切pMDl 8-T-hly，载体和表达载体pET-32al(+)，并连接获得重组表达质粒pET-32a(+)-hly。经过双酶切和PCR鉴定正确后，转化到Ecoli BL21(DE3)感受态细胞中，构建相应的表达工程菌。利用温度诱导，在30V诱导培养3.5h后，该工程菌的SDS-PAGE分析显示，有一条相对分子质量约为60kDa的表达蛋白区带，与预期的LLO蛋白的大小相符。经TotalLab2.0图像软件分析，重组LLO蛋白(rLLO)以包涵体形式存在，表达量约占全菌蛋白的65.48％。 根据重组蛋白C端带有6×His标签的特征，用螯合镍离子．次氨基三乙酸(Ni-NTA)的亲和层析柱对重组蛋白进行一步纯化。在变性条件下LLO经pH梯度洗脱，目的蛋白出现在pH 4.5洗脱液中，其纯度达96.21％，经亲和纯化方法可获得约2mg/ml的rLLO蛋白。 将单增李斯特菌和纯化后的rLLO蛋白、葡萄球菌肠毒素免疫新西兰大白兔分别制备抗单增李斯特菌和抗rLLO、SE的多克隆抗体，获得的免疫血清经正辛酸-硫酸铵分步沉淀法和蛋白A亲和层析纯化，其纯度约达98％，定量抗体浓度约为4mg/mL，间接ELISA法检测抗体效价为1：10<'8>以上，WB结果表明所制备的抗原具有很好的免疫原性。纯化后的抗单增李斯特菌、抗SE和抗rLLO多抗，利用胶体金免疫层析技术，采用双抗体夹心法研制了胶体金检测试纸条，用于检测单增李斯特菌、SE和LLO，并对该方法进行特异性、敏感性、稳定性等评价。该检测方法能在5～10min内完成样品检测，多种不同的菌、蛋白及近缘毒素检测评价显示该法特异性良好，检测灵敏性高，SE在奶粉、血清、牛奶、火腿肠等环境样品的检测敏感性也相同。其中单增李斯特菌的敏感性达到10<'6>CFU/mL，LLO的敏感性能达到150ng/mL，SEA的敏感性能达到10ng/mL，SEB的敏感性能达到1ng/mL，SEC的敏感性能达到10ng/mL；37℃15天加速试验表明所研制的五种试纸条的稳定性良好，保存期在一年以上。本研究建立的胶体金检测方法灵敏、准确、特异性强，可进一步应用到检验检疫部门对进出口食品中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的检测实际工作中。此方法建立后，可与经典常规方法互补，预计将在检验检疫、食品工业部门及卫生监控部门具有较广的应用前景，有一定的经济和社会效益。同时，可为食品微生物检验国际方法的修订或增补提供科学依据。

目录

论文说明：缩略词表

声明

摘要

前言

第一章文献综述

第二章单增李斯特菌免疫胶体金检测试纸条的研制

1材料与方法

1.1实验材料

1.2主要设备与仪器

1.3试验方法

2结果与分析

2.1抗原的获得和鉴定

2.2单增李氏菌免疫效应分析

2.3单增李斯特菌胶体金检测试纸条的研制和性能检测

2.4比对试验

3小结

第三章李斯特菌溶血素0免疫胶体金检测试纸条的研制

1材料与方法

1.1试验材料

1.2工具酶和试剂

1.3标准参照物

1.4主要试剂的配制

1.5实验动物

1.6主要设备与仪器

1.7试验方法

1.8胶体金的制备

1.9李斯特菌溶血素0重组蛋白胶体金测试纸条的研制和性能评价

2结果与分析

2.1李斯特菌溶血素0重组蛋白抗原的获得和鉴定

2.2 LLO抗体的免疫效应分析

2.3李斯特菌溶血素0重组蛋白胶体金检测试纸条的研制和性能检测

3小结

第四章A型葡萄球菌肠毒素免疫胶体金检测试纸条的研制

1材料与方法

1.1试验材料

1.2主要仪器和试剂

1.3试剂和材料的处理

1.4试验方法

2结果与分析

2.1 SEA抗原的获得和鉴定

2.2 SEA免疫效应分析

2.3 SEA胶体金检测试纸条的研制和性能检测

2.4 SEA胶体金检测条的性能评价

3小结

第五章B型葡萄球菌肠肠毒素免疫胶体金检测试纸条的研制

1材料与方法

1.1试验材料

1.2主要仪器和试剂

1.3试剂和材料的处理

1.4试验方法

2结果与分析

2.1 SEB抗原的获得和鉴定

2.2 SEB免疫效应分析

2.3 SEB胶体金检测试纸条的研制和性能检测

2.4 SEB胶体金检测条的性能评价

3小结

第六章C型葡萄球菌肠毒素免疫胶体金检测试纸条的制备

1材料与方法

1.1试验材料

1.2主要仪器和试剂

1.3试剂和材料的处理

1.4试验方法

2结果与分析

2.1 SEC抗原的获得和鉴定

2.2 SEC免疫效应分析

2.3 SEC皎体金检测试纸条的研制和性能检测

2.4 SEC胶体金检测条的性能评价

3小结

第七章结论与讨论

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表文章，获得专利和参与的主要课题