氟中毒大鼠骨组织中Wnt/β-catenin信号通路的改变

摘要

前言:
　　 地方性氟中毒(endemicfluorosis)简称地氟病,属地球化学性疾病,是一种以氟斑牙(dentalfluorosis)和氟骨症(skeletalfluorosis)为主要特征的全身慢性中毒性疾病。氟骨症病理表现形式是以成骨细胞功能活跃以及与此密切相关的骨转换加速为其主要特征。研究表明,氟能够通过刺激成骨细胞成骨而使骨量增加、骨密度升高。氟中毒时,成骨细胞细胞数增多、胞体肥大、DNA合成增加、各种骨形成标志物水平升高,呈明显活跃状态。
　　 Wnt信号通路是近年来骨代谢中的研究热点,Wnt/β-catenin信号通路组分基因敲除和转基因鼠模型以及一些体外实验都表明Wnt/β-catenin信号通路在调节骨代谢以及成骨细胞的分化增殖中扮演着重要角,促进成骨细胞的增殖,分化及成熟。
　　 目前,国内外对Wnt/β-catenin信号通路的研究主要集中于骨关节炎和骨质疏松等疾病上,在地方性氟中毒中是否发挥作用,尚未见相关文献报道。鉴于地方性氟中毒的氟骨症表现、氟对成骨细胞的作用以及Wnt/β-catenin信号通路在成骨细胞中发挥的作用,我们拟通过复制慢性氟中毒大鼠模型,观察β-catenin在骨组织中的mRNA和蛋白表达水平,初步探讨Wnt/β-catenin信号通路在氟骨症中可能发挥的作用,为阐明地方性氟中毒的发病机制提供新的思路。
　　 实验方法:
　　 一、实验动物分组
　　 选取购自中国医科大学实验动物中心刚断乳Wistar雄性大鼠32只,体重50-80克,按体重随机分成四组,每组八只,其中对照组饮用自来水(含F-0.118mg/L)、低氟组(含F-50mg/L的自来水)、中氟组(含F-100mg/L的自来水)、高氟组(含F-150mg/L的自来水)。各组大鼠用标准啮齿类动物饲料喂养,自由饮水及进食,实验周期为3个月。
　　 二、实验方法
　　 1、大鼠生长发育状况观察
　　 整个实验周期内,观察大鼠生长发育状况,每周称取大鼠体重并作记录同时观察大鼠牙齿变化。
　　 2、血氟测定
　　 实验周期结束后,乙醚麻醉大鼠,腹主动脉采血,分离得到血清,采用痕量氟化物测定方法检测血中氟离子浓度。
　　 3、骨氟测定
　　 大鼠取完血后处死,快速取其左侧股骨,并取下股骨近端1/3,迅速剔除肌肉、骨膜等结缔组织,剔净后100℃烤箱内烤干至恒重,研磨成粉状,采用高温燃烧水解氟电极法测骨氟含量。
　　 4、HE切片病理学观察及骨形态计量学分析
　　 大鼠处死后,迅速剥离左侧完整胫骨,固定脱钙后常规石蜡包埋,冠状位切片后制成石蜡切片。常规脱蜡水合,苏木素伊红染色后,进行病理学观察和形态计量学静态参数分析。
　　 5、提取骨组织RNA进行目的基因mRNA表达水平检测
　　 使用RNAiso试剂盒提取骨组织RNA,按照PrimeScript(R)RTreagentKit说明书反转录得到cDNA,SYBR(R)PremixExTaqTMⅡ说明书进行实时定量聚合酶链式反应,通过数据分析目的基因mRNA表达水平。
　　 6、石蜡切片免疫组织化学染色
　　 石蜡切片常规脱蜡水合后以兔抗大鼠β-catenin多克隆抗体为一抗,以生物素化山羊抗兔IgG为二抗,DAB显色,苏木素复染,常规酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,照相。
　　 三、统计分析方法
　　 采用SPSS11.0软件对实验数据进行统计学分析处理。
　　 所有实验数据采用单因素方差分析方法进行分析。P值小于0.05认为有统计学意义。
　　 结果:
　　 1、大鼠一般生长情况
　　 实验周期内,对照组和实验组大鼠体重增加量相似,呈动态变化。各组大鼠体重差别无统计学意义(P>0.05)。
　　 2、大鼠血氟和骨氟水平
　　 各实验组大鼠的血氟和骨氟水平较对照组都明显升高(P<0.01),并且血氟和骨氟水平随着染毒剂量的增高而升高。
　　 3、骨组织病理学观察及形态计量学分析
　　 低倍镜下(10×)可见,与对照组相比,实验组大鼠骨小梁增多,排列紊乱且相互连接成网,并且随染氟剂量的升高,上述骨小梁改变明显。
　　 染氟三个月后,与对照组相比,150mg/LF-组大鼠骨小梁面积百分数(%Tb.Ar)、骨小梁数目(Tb.N)明显升高(P<0.05),50mg/LF-组以及100mg/LF-组大鼠骨小梁面积百分数(%Tb.Ar)虽增高但无统计学意义(P>0.05)。骨小梁数目(Tb.N)明显升高(P<0.05)。各实验组骨小梁分离度(Tb.Sp)明显降低(P<0.05),骨小梁厚度(Tb.Th)呈降低趋势,但没有统计学意义(P>0.05)。
　　 4、氟对大鼠骨组织中β-catenin及Lrp5、Runx2mRNA表达的影响
　　 与对照组相比各实验组β-catenin、Lrp5、Runx2mRNA表达含量升高,其中100mg/LF-组以及150mg/LF-组β-catenin、Lrp5mRNA表达含量较对照组比有统计学意义(P<0.05),Runx2mRNA表达含量无统计学意义(P>0.05)。
　　 5、氟对大鼠骨组织中β-catenin蛋白表达的影响
　　 在高倍镜(40×)下可见,与对照组相比染氟组大鼠成骨细胞中可见β-catenin阳性表达,主要表达于皮质骨内包被以及骨小梁包被的成骨细胞系。各实验组随着染氟剂量的升高,阳性表达的细胞数目增多、范围扩大。
　　 结论:
　　 1、不同浓度(50mg/L、100mg/L、150mg/L)饮水型氟中毒大鼠模型呈现出骨量增多的硬化型氟骨症改变,表现为骨小梁数目增多、排列紊乱。
　　 2、氟能够促进大鼠骨组织中Wnt/β-catenin信号通路组分β-catenin及其上游因子Lrp5的基因转录和β-catenin蛋白表达。