TRPV1在胃食管反流豚鼠模型气道神经源性炎症中作用的研究

摘要

前言:
　　 胃食管反流(gestroesophageal reflux，GER)相关性呼吸系统病变一直是呼吸领域关注的热点之一。许多临床及动物实验已发现GER与慢性咳嗽、支气管哮喘、肺纤维化以及慢性阻塞性肺疾病等呼吸系统病变具有相关性。其中胃食管反流性咳嗽为慢性咳嗽的常见病因之一，其发生机制未完全明确，多认为与胃食管反流引起气道炎症及咳嗽敏感性增加有关。而引起气道炎症的机制主要认为与微量或大量误吸胃内容物（酸性和非酸性物质）直接或间接刺激气道引起气道炎症、感觉神经（主要为无髓C神经纤维）参与的食管-支气管神经反射及气道感觉神经肽释放所致的神经源性炎症等因素有关。上述机制均有感觉神经C纤维参与，当食管或气道内出现酸性物质时，刺激分布在食道及气道内C神经纤维末梢的伤害性感受器，引起C神经纤维冲动增加，通过轴突反射释放神经肽引起神经源性炎症。同时，冲动传至中枢，与孤束核及相应节段脊髓的神经元形成突触，引起呼吸反射。瞬时感受器电位香草酸受体1(Transient receptor potential vanilloid1，TRPV1)为离子通道蛋白，分布于C神经纤维末梢，为其主要的离子通道蛋白之一。TRPV1通道蛋白在酸等化学性刺激后开放，引起阳离子（主要为钙离子）进入细胞内，导致神经纤维冲动增加，引起神经元胞体内感觉神经肽合成和分泌增加。这些感觉神经肽包括:降钙素基因相关肽、P物质(P substance，SP)、神经肽A、神经肽B等。感觉神经兴奋后，这些感觉神经肽释放到肺及气道，引起神经源性炎症，主要表现为血管扩张，微血管渗漏，气管及支气管的收缩，上皮杯状细胞和粘膜下腺体粘液分泌增加，增强胆碱能神经传递等。理论上讲，如能抑制TRPV1受体，会减轻胃食管反流所致的气道炎症。本课题组已证实SP参与了胃食管反流性气道高反应的发病过程，食管灌注盐酸GER豚鼠模型的C7-T5脊神经节和相应节段脊髓背角内的SP表达增加，但TRPV1活性改变能否影响GER模型气道及肺组织SP的表达并进而影响气道炎症程度目前尚不清楚，故本研究以多次盐酸灌注豚鼠食管GER动物模型为研究对象，观察该动物模型气道及感觉神经内脏传入部位TRPV1表达情况、改变TRPV1活性是否能影响胃食管反流动物模型气道炎症程度以及是否可以影响肺部神经肽SP及促炎因子IL-8表达，试图为临床应用TRPV1拮抗剂治疗胃食管反流性咳嗽等GER相关性呼吸系统病变提供实验依据。
　　 材料与方法:
　　 1、多次盐酸灌注豚鼠食管胃食管反流动物模型建立
　　 白化豚鼠（普通级雄性）40只，体重350g±50g，随机分为4组:PBS对照组（对照组）;HCL模型组（模型组）;HCL+Capsaicin组(CAP组);HCL+Capsazepine组(CPZ组)。模型组食管盐酸灌注方法:腹腔注射盐酸氯胺酮(50mg/kg)轻度麻醉豚鼠，仰卧位固定于鼠台上，经口将5F胃管插入豚鼠食管的中、下段(插入深度约11-13cm)，以26ml/h速度缓慢灌注0.1 mol/L HC1溶液（含0.5％胃蛋白酶），每天1次，每次20min，连续14d。对照组:用PBS代替盐酸灌注食管，方法同上。HCL+CAP组在每次灌酸前30分钟按5mg/kg腹腔注射Capsaicin（辣椒素，TRPV1受体激动剂）。HCL+CPZ组在每次灌酸前30分钟按1μmol/kg腹腔注射Capsazepine（辣椒平，TRPV1受体抑制剂）。对照组和模型组在每次灌酸前30分钟按1ml/kg腹腔注射溶媒（含10％乙醇和10％吐温80的生理盐水溶液）。
　　 2、豚鼠肺功能测定
　　 末次灌注24h后，各组豚鼠进行肺功能测定，清醒非限制活动状态下的豚鼠置于小动物肺功能检测分析仪（Emka公司，法国）的整体体描箱内，检测豚鼠在雾化吸入倍增浓度乙酰甲胆碱(基础值、0、25、50、100、200、400、800mg/l)后肺功能参数吸气时间(Ti)、呼气时间(Te)、吸气峰值流速(PIF)、呼气峰值流速(PEF)、潮气量(TV)、呼吸频率(F)及分钟通气量(MV)的变化。
　　 3、支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞计数及分类
　　 测定豚鼠肺功能后，戊巴比妥（按80mg/kg）腹腔注射麻醉豚鼠，仰卧位固定，分离气管，开胸结扎右主支气管，经气管插管行左肺灌洗无菌PBS，收集BALF并离心、涂片及HE染色，进行细胞计数及分类。
　　 4、HE染色观察食管，气管和肺组织病理变化
　　 各组豚鼠4％多聚甲醛经左心室全身灌流固定后，取气管、肺及食管制作石蜡切片，HE染色，同一有经验的病理医师光镜下对比观察各组织炎症改变情况。
　　 5、免疫组织化学染色检测TRPV1、SP的表达
　　 取各组的气管、肺组织、C7-T5段脊髓和相应节段脊神经节石蜡切片，参照SABC法免疫组织化学试剂盒步骤检测气管、C7-T5段脊髓和相应节段脊神经节及肺组织TRPV1表达及肺组织中SP的表达情况。
　　 6、免疫印迹检测气管、肺组织及C7-T5段脊髓中TRPV1表达。
　　 气管、肺组织及C7-T5段脊髓中蛋白提取和定量后，取等量样品进行聚丙烯凝胶电泳，经一抗和二抗孵育后显色，图像分析。
　　 7、ELISA方法检测各组豚鼠BALF中SP及IL-8表达情况。
　　 8、统计学分析
　　 所有原始数据采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。结果均表示为均数±标准差，四组间比较采用单因素方差分析，正态分布并方差齐时，两两比较采用LSD检验;方差不齐时应用Tamhane' sT2检验，非正态分布采用轶和检验，P＜0.05差异有统计学意义。
　　 实验结果:
　　 1、四组豚鼠食管、支气管和肺组织病理检测
　　 正常对照组豚鼠食管结构基本正常;模型组食管可见轻度炎症改变，如:上皮层轻度增厚，上皮过度角化，同时乳头延长，基底层及棘层细胞增生，固有层可见炎症细胞浸润，粘膜下层内血管扩张，充血。对照组气管、支气管、肺组织HE染色未见明显异常改变;但模型组可见明显炎症改变:气管可见部分上皮结构紊乱，部分脱落，在粘膜和粘膜下层，可见血管充血、扩张，炎症细胞如中性粒细胞、淋巴细胞和少许嗜酸性粒细胞浸润，肺组织、细支气管管壁及管腔内可见中性粒细胞、淋巴细胞及少许嗜酸性粒细胞浸润，细支气管管壁略增厚，管腔狭窄，部分可见粘液栓。CAP组上述改变较模型组加重，而CPZ组上述组织炎症改变减轻。
　　 2、四组豚鼠肺功能测定
　　 四组豚鼠肺功能参数基础值无统计学差异，随Mch浓度的递增，四组豚鼠均逐渐出现呼吸费力，辅助呼吸肌（腹肌）参与呼吸运动，严重时出现张口呼吸，耳及吻部皮肤发绀，甚至出现意识改变，呼吸波形图提示呼吸频率轻度增快后明显减慢、但PEF及PIF较基础值明显增加等表现。模型组和CAP组豚鼠接受200mg/(l)Mch雾化吸入激发后出现严重呼吸困难，无法接受下一剂量药物刺激;CPZ组豚鼠接受400mg/(l)Mch雾化吸入激发后出现严重呼吸困难，无法接受下一剂量药物刺激;对照组豚鼠完成全部剂量Mch的激发刺激。在剂量为100mg/(l)起，四组豚鼠吸气时间、呼气时间、呼吸频率、潮气量、吸气峰流速、呼气峰流速、分钟通气量差异明显增大，具有统计学意义。
　　 3、各组BALF中细胞计数、分类比较
　　 与对照组比较，模型组BALF中细胞总数、中性粒细胞及淋巴细胞占细胞总数百分比明显增加（P＜0.01），CAP组中性粒细胞比例较模型组有所升高，但无统计学意义;CPZ组较模型组明显下降（P＜0.01）。模型组、CAP组CPZ组豚鼠BALF中嗜酸细胞所占比例略高于对照组，但四组间比较差异无统计学意义。
　　 4、免疫组织化学染色及分析
　　 四组气管、肺组织、C7-T5段脊神经节和相应节段脊髓背角中均有TRPV1的表达，但强弱不同，模型组表达明显高于对照组（P＜0.01），CAP组较模型表达增加，而CPZ组各组织中TRPV1表达较模型组下降(P＜0.01)。模型组下呼吸道SP表达水平明显高于对照组，CAP组强于模型组，而CPZ组较模型组表达明显减少(P＜0.01)。
　　 5、免疫印迹检测TRPV1的表达
　　 四组组气管、肺组织、C7-T5段脊髓中均有TRPV1的表达，模型组表达明显高于对照组（P＜0.01），而CPZ组表达较模型组下降(P＜0.01)，CAP组较模型组TRPV1在气管肺组织及脊髓中表达增加。
　　 6、各组BALF中SP及IL-8含量比较
　　 ELISA方法检测BALF中SP及IL-8结果提示:模型组SP及IL-8含量明显高于对照组（P＜0.01），而CAP组SP含量较模型组增高（P＜0.01），CAP组BALF中IL-8虽高于模型组，但差异没有统计学意义;CPZ组SP及IL-8含量较模型组均降低(P＜0.01)。
　　 结论:
　　 1、多次盐酸灌注食管可引起豚鼠气道及肺组织明显神经源性炎症改变，引起豚鼠对Mch刺激反应敏感性增强，可能为胃食管反流相关性咳嗽的发病基础。
　　 2、TRPV1在胃食管反流性相关性气道炎症发生中起着重要作用，抑制TRPV1活性可以减轻GER豚鼠模型气道及肺组织炎症程度，改善其肺功能。
　　 3、通过影响气道及肺内SP的表达可能为TRPV1参与气道神经源性炎症的机制之一。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 多次食管灌酸胃食管反流豚鼠模型建立及肺功能测定

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

附表、附图

论文二 TRPV1在GER豚鼠模型气道及内脏传入部位表达及对气道神经源性炎症的影响

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

附表、附图

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述

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