过氧化物酶体增殖物激活受体γ在COPD气道炎症及肺气肿形成中的作用和机制

摘要

COPD是一种以不完全可逆气流受限为表现的慢性气道炎症性疾病，气流受限呈进行性发展，与肺部对有害气体或颗粒，特别是吸烟所致的异常慢性气道炎症相关。慢性支气管炎和肺气肿是其病理基础，蛋白酶/抗蛋白酶失衡是其重要发病原因之一，寻找蛋白酶/抗蛋白酶失衡上游调解途径并加以干预可能对疾病的发展起到延缓作用。
　　过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)是配体调控的核受体超家族成员之一，包含α、γ和β/δ三种亚型，其中PPAR-γ在正常人肺组织细胞及炎症细胞上均有不同程度的表达。研究发现，PRAR-γ在多个器官和多种疾病中发挥抗炎症、抗重建和抗增殖作用。目前，PPAR-γ在肺部炎症中的作用越发受到关注，并已在动物模型中证实，PPAR-γ激动剂能减轻肺间质纤维化、哮喘、脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)引起的多器官功能衰竭及缺血-再灌注所致的肺损伤。但PPAR-γ在COPD肺部炎症中的作用尚不清楚，明确PPAR-γ在COPD肺部炎症中的作用及机制，可能为寻找新的治疗靶点提供理论依据。
　　为了探讨PPAR-γ在COPD慢性气道炎症和肺气肿发生发展中的作用，本研究拟通过动物实验和COPD患者临床实验进行评价。动物实验中构建香烟烟雾诱导大鼠肺气肿模型，观察PPAR-γ在香烟所致的肺气肿中的表达变化，并应用PPAR-γ激动剂罗格列酮激活PPAR-γ，观察PPAR-γ表达对大鼠肺气肿程度及肺组织MMP-2、MMP-9表达的影响，另外，进一步评价TLR-4和MAPK途径是否参与到PPAR-γ对MMP-2、MMP-9表达的影响。临床试验中拟通过测定COPD患者诱导痰中的PPAR-γ水平与健康受试者进行比较，观察其水平的变化。同时评估PPAR-γ与MMP-9、MMP-9/TIMP-1之间的相关性。另外，评估上述指标与COPD患者临床指标尤其是HRCT肺气肿定量分析之间的相关性。
　　材料与方法:
　　1.动物实验:(1)将24只健康雄性Wistar大鼠随机数字表法分为正常对照组、肺气肿模型组、罗格列酮组，每组8只。模型组、罗格列酮组熏烟12周，罗格列酮组同时接受罗格列酮(30mg/kg)日一次灌胃。12周后处死大鼠，取材。(2)病理标本的制备及形态定量分析:取每只大鼠的右下叶肺组织，石蜡包埋切片，常规HE染色。对HE染色标本进行平均肺泡数、平均肺泡直径和平均肺泡面积的测定。(3)采用免疫组织化学染色及Western blot检测PPAR-γ、 TLR-4、MMP-9、MMP-2蛋白表达的情况。(4)采用Real-time PCR检测PPAR-γ、 TLR-4、MMP-9、MMP-2 mRNA的水平。(5)采用Western blot检测ERK1/2、p38MAPK、JNK磷酸化水平的变化。(6)采用Western blot检测磷酸化IK-Bα的蛋白表达。
　　2.临床试验:选取中国医科大学附属第一医院呼吸疾病研究所随访的66例稳定期COPD患者作为研究对象，同时选取12例不吸烟的健康志愿者作为对照。所有受试者进行肺功能检查及留取诱导痰。COPD患者进行肺HRCT检查，并测定LAA％和肺气肿体积百分比。进行SGRQ、CAT、MMRC呼吸困难问卷，进行6分钟步行试验(6 minute walking test，6MWT)测定6分钟步行距离(6 minute walkingdistance，6MWD)。依试剂盒说明采用ELISA方法测定诱导痰中PPARγ、 MMP-9、TIMP-1和MMP-9/TIMP-1表达情况
　　结果:
　　1、动物实验:(1)各组大鼠肺组织形态学比较:与对照组相比，模型组大鼠的MAN减少，MLI和MAA增大(p＜0.01)，肺气肿模型复制成功。与模型组相比，罗格列酮能减轻肺气肿的形成(p＜0.01)。(2)各组大鼠肺组织中PPAR-γ表达水平比较:免疫组化、Western blot和real-time PCR结果显示与正常对照组比较，模型组肺组织内的PPAR-γ蛋白和mRNA表达下降(p＜0.01)。与模型组对比，罗格列酮组PPAR-γ蛋白和mRNA表达显著增高（p均＜0.01）。(3)各组大鼠肺组织中TLR-4的表达水平比较:免疫组化、Western blot和real-time PCR结果显示与正常对照组比较，模型组肺组织内的TLR-4蛋白和mRNA表达增高(p＜0.01)。与模型组对比，罗格列酮组TLR-4蛋白和mRNA表达显著减低（p均＜0.01）。(4)各组大鼠肺组织中MMP-2、MMP-9的表达水平比较:免疫组化、Western blot和real-time PCR结果显示与正常对照组比较，模型组肺组织内的MMP-2、MMP-9的蛋白和mRNA表达增高(p＜0.01)。与模型组对比，罗格列酮组MMP-2、MMP-9的蛋白和mRNA表达显著降低（p均＜0.01）。(5)各组大鼠肺组织中ERK1/2、p38MAPK、JNK磷酸化水平比较:Western blot结果显示与正常对照组比较，模型组肺组织内的ERK1/2、p38MAPK、JNK磷酸化水平增高(p＜0.01)。与模型组对比，罗格列酮组ERK1/2、p38MAPK、JNK磷酸化水平下降(p＜0.05）。(6)各组大鼠肺组织中IK-Bα磷酸化水平比较:Western blot结果显示与正常对照组比较，模型组肺组织内的IK-Bα磷酸化水平下(p＜0.01);与模型组对比，罗格列酮组IK-Bα磷酸化水平升高(p＜0.05)。
　　2、临床试验:(1)与健康受试者比较，COPD患者诱导痰中PPAR-γ和TIMP-1水平减低，MMP-9及MMP-9/TIMP-1增高(p＜0.01)。伴有肺气肿的患者和肺功能分级差的患者其诱导痰中PPAR-γ和TIMP-1水平减低，MMP-9及MMP-9/TIMP-1增高更为明显。(2) COPD患者诱导痰中PPAR-γ与TIMP呈正相关(r=0.517，p＜0.001)，与MMP-9、MMP-9/TIMP-1呈负相关(MMP-9:r=-0.286，p=0.025;MMP-9/TIMP-1:r=-0.417，p=0.001);并且上述指标与FEV1、FEVI％、6MWD、BODE指数、LAA％和肺气肿体积百分比等指标相关。肺气肿体积百分比与与PPAR-γ和TIMP-1呈负相关(PPARγ:r=-0.331，p=0.009; TIMP-1:r=-0.514，p＜0.001)，与MMP-9和MMP-9/TIMP-1正相关(MMP-9:r=0.579，p＜0.001;MMP-9/TIMP-1: r=0.666，p＜0.001)，即:肺气肿的严重程度与PPAR-γ和TIMP-1呈负相关，与MMP-9和MMP-9/TIMP-1正相关。
　　结论:
　　1、香烟烟雾诱导大鼠肺气肿及慢性气道炎症，其下调了PPAR-γ的表达，引起大鼠肺组织内IK-Bα磷酸化水平下降，TLR-4表达增加， ERK1/2、p38MAPK、JNK磷酸化增强，使MMP-2、MMP-9表达增加。2、PPAR-γ激动剂罗格列酮通过活化PPAR-γ，实现对烟雾诱导的大鼠肺组织内MMP-2，MMP-9蛋白酶失衡的调节作用，减轻香烟烟雾诱导的肺气肿，其可能是通过抑制减低TLR-4表达及抑制ERK1/2、p38MAPK、JNK磷酸化来实现这一作用。3、COPD患者诱导痰中PPAR-γ和TIMP-1较健康受试者的水平下降，而MMP-9、MMP-9/TIMP-1水平增高。伴有肺气肿的COPD患者诱导痰中PPAR-γ、TIMP-1水平减低和MMP-9、MMP-9/TIMP-1水平增高更为明显;诱导痰中PPAR-γ与TIMP-1呈正相关，与MMP-9、MMP-9/TIMP-1呈负相关，与肺气肿严重程度呈负相关，提示PPAR-γ通过对蛋白酶/抗蛋白酶系统的调节发挥其减轻COPD气道炎症和肺气肿的作用。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 PPARγ在香烟烟雾诱导肺气肿大鼠肺组织中的表达及其对MMP-2、MMP-9表达的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文二 PPAR7对TLR4及MAPK途径的调控作用及其与烟雾诱导肺气肿大鼠肺组织蛋白酶失衡的相关性

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文三 COPD患者诱导痰中PPAR-γ、MMP-9、TIMP-1的变化及其与肺气肿定量分析相关性的研究

前言

对象与方法

结果

讨论

结论

参考文献

本研究创新性自我评价

综述 过氧化物酶体增殖物激活受体γ在慢性阻塞性肺疾病肺部炎症中的作用

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