过氧化物酶体增殖物激活受体γ在COPD大鼠肺部慢性炎症中的作用及机制

摘要

目的：
　　为了探讨PPARγ在COPD发生机制中的作用，本课题拟从活体和离体水平研究PPARγ在香烟所致的肺部慢性炎症中的表达变化，并应用PPARγ天然配体15-脱氧前列腺素J2(15-deoxy-Delta12，14-prostaglandin J2，15d-PGJ2)和合成配体罗格列酮激活PPARγ，观察其表达与炎症反应的关系。为了进一步探索PPARγ的具体作用机制，本研究通过配体激活PPARγ，观察其对香烟所致的TLR2、TLR4表达及NF-κB、ERK活化的影响。为了阐明PPARγ两种配体是通过活化PPARγ来起作用的，实验还观察了PPARγ特异性抑制剂双酚A型环氧树脂（bisphenol A diglycide ether，BADGE）是否能够逆转15d-PGJ2和罗格列酮的作用。上述研究将有助于提高对COPD发病机制的认识，为探索治疗COPD的新的靶点提供了理论和实验依据。
　　方法：
　　实验分为体内和体外实验两部分，体内实验主要是通过观察COPD大鼠肺组织中PPARγ表达及罗格列酮对肺部形态学和炎症介质的影响，来探索PPARγ在香烟所致的肺部慢性炎症中的作用;体外实验是在原代肺泡巨噬细胞(alveolarmacrophages，AMs)和人支气管上皮细胞系(Human Bronchial Epithelial Cells，16HBE)细胞中观察15d-PGJ2和罗格列酮对香烟诱导的TLR2、TLR4表达及NF-κB、ERK活化的影响，以进一步探讨PPARγ的具体作用机制。
　　1、体内实验部分
　　(1)动物分组和COPD模型的制备:健康雄性Wistar大鼠40只，按随机数字表法分为正常对照组、COPD模型组、罗格列酮组和罗格列酮+BADGE组(RB组)，每组10只。模型组、罗格列酮组和RB组大鼠用自制熏烟箱每天吸烟2次，每次16支香烟，熏烟12周，ROSI组大鼠在每天吸烟前30分钟用罗格列酮(30mg/kg)灌胃1次，RB组大鼠在每天吸烟前30分钟分别用罗格列酮(30mg/kg)灌胃和BADGE(30mg/kg)腹腔注射1次。正常对照组吸入室内空气。
　　(2)肺功能的测定:烟熏结束后第2日，模型组大鼠行小动物肺功能检测以明确气流受限程度。
　　(3)病理标本的制备及形态定量分析:取每只大鼠的右下叶肺组织，石蜡包埋切片，常规HE染色。对HE染色标本进行气道炎症及肺实质病理评分、每视野的平均肺泡数和平均肺泡直径的测定。
　　(4)炎症介质与细胞因子检测:酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)检测各组大鼠BALF、肺组织匀浆及血清中炎性介质LTB4和细胞因子IL-8的含量。
　　(5)BALF液中细胞分数:BALF沉渣甩片，常规HE染色，行淋巴细胞、中性粒细胞、肺泡巨嗜细胞计数。
　　(6)免疫组化染色:采用SABC(Strept Actividin-Biotin Complex)法，对石蜡包埋标本行TLR2、TLR4和PPARγ相对含量的测定。
　　(7)RNA提取及实时定量PCR(Realtime-PCR)扩增:大鼠处死后，剖胸取右中上肺组织50mg，液氮速冻，按RNA提取试剂盒操作说明进行总RNA的提取，扩增TLR2、4和PPARγ CDNA序列。
　　2、体外实验部分
　　(1)纯化肺泡巨嗜细胞:各组大鼠处死后，夹闭其右主支气管，向气管缓慢注入生理盐水4毫升灌洗左肺，反复3次，体外培养2小时以获得纯化的AMs。
　　(2)提前2小时给与5μm15d-PGJ2、50μm罗格列酮、5μm15d-PGJ2+100μmBADGE及50μm罗格列酮+100μm BADGE处理正常AMs或16HBE，再用1％、5％的香烟烟雾提取物（cigarette smoke extrat，CSE）刺激细胞。
　　(3)5μm15d-PGJ2、50μm罗格列酮、5μm15d-PGJ2+100μm BADGE及50μm罗格列酮+100μm BADGE预处理AMs及16HBE，应用RT-PCR、western blot及流式检测其对1％CSE诱导的TLR2和TLR4表达变化的影响，以明确PPARγ对TLR的调控作用。
　　(4)16HBE给予NF-κB的阻断剂PDTC和ERK阻断剂PD98059后，RT-PCR、western blot及流式检测阻滞剂对15d-PGJ2和罗格列酮所致TLR表达变化的影响，来探讨PPAR-γ对TLR的具体调控机理。
　　结果：
　　1、体内实验
　　(1)肺功能检测:与正常对照组比较，模型组大鼠FEV0.3/FVC×100％、PEF明显下降（P均＜0.01），说明存在明显气流受限。
　　(2)肺组织形态学测量结果
　　与对照组相比，模型组大鼠肺体积增大，表面不平。光镜下可见支气管黏膜上皮脱落，管壁及周围大量的单核细胞和淋巴细胞浸润，杯状上皮细胞增生肥大，气道腔内炎细胞渗出;肺泡结构紊乱，肺泡壁变薄或断裂，肺泡呈囊状扩张，部分融合成肺大疱，符合COPD肺部病理形态学改变。结合上述肺功能结果，说明COPD模型复制成功。
　　(3)BALF及肺组织匀浆中LTB4和IL-8的含量
　　与对照组比较，模型组大鼠BALF及肺组织匀浆中LTB4及IL-8含量均明显增高（P均＜0.05）。与模型组比较，罗格列酮组BALF及肺组织匀浆LTB4和IL-8含量减少（P均＜0.05）。
　　(4)PPARγ的表达水平
　　免疫组化和real-time PCR结果显示:与正常对照组比较，模型组肺泡上皮细胞及气道上皮细胞的PPAR-γ表达下降(p＜0.00)。与模型组对比，罗格列酮组和RB组PPAR-γ mRNA和蛋白表达显著增高（p均＜0.01），但RB组PPAR-γ表达低于罗格列酮组(p＜0.05)。
　　(5)TLR2、TLR4的表达水平
　　免疫组化和real-time PCR结果显示:与正常对照组比较，模型组肺泡上皮细胞及气道上皮细胞的TLR2和TLR4表达增加（p均＜0.05）。与模型组对比，罗格列酮组和RB组TLR2和TLR4 mRNA和蛋白表达显著减少（p均＜0.05）。
　　2、体外实验部分
　　(1)AMs功能及AMs和16HBE代谢活性
　　与正常对照组比较，模型组AMs吞噬功能显著下降(p＜0.05)。与模型组比较，罗格列酮组AMs吞噬能力有所改善(p＜0.01)。与模型组相比，RB组差别无统计学意义（p＞0.05）。1％CSE刺激各组AMs18小时后，与正常对照组比较，模型组AMs吞噬能力明显下降（p均＜0.01）。与模型组比较，罗格列酮组AMs吞噬能力增加(p均＜0.05)。与模型组相比，RB组AMs吞噬能力差别无统计学意义（p＞0.05）。
　　(2)AMs培养液上清及16HBE中LTB4含量
　　与正常细胞对比，5％CSE刺激后的AMs培养液上清中和16HBE中LTB4含量明显增高（p均＜0.05）。与单纯5％CSE刺激比较，提前给与15d-PGj2或罗格列酮可使培养液和16HBE中的LTB4含量减少（p均＜0.05）。与单纯5％CSE刺激比较，15d-PGj2+ BADGE作用后培养液和16HBE中的LTB4含量减少（p均＜0.05)，但较单独15d-PGj2处理，16HBE中的LTB4有所增加(p＜0.05)。与单纯5％CSE刺激比较，罗格列酮+BADGE作用后的培养液和16HBE中LTB4含量差异无统计学意义(p＞0.05)。
　　(3)PPARγ在AMs及16HBE中的表达
　　与正常对照组比较，模型组AMs的PPARγ显著下降(p＜0.05)。与模型组比较，罗格列酮组和RB组AMs中PPAR-γ mRNA和蛋白表达显著增高（p均＜0.05），但RB组PPAR-γ表达低于罗格列酮组(p＜0.05)。
　　(4)TLR2和TLR4在AMs及16HBE中的表达
　　与正常对照组比较，模型组AMs中TLR2和TLR4表达增加。与模型组对比，罗格列酮组和RB组AMs中TLR2和TLR4 mRNA和蛋白表达显著减少（p均＜0.05），但RB组TLR2和TLR4表达高于罗格列酮组（p均＜0.05）。
　　结论：
　　1、PPARγ与肺部慢性炎症有关，PPARγ表达异常可能是COPD发病原因之一。
　　2、活化PPARγ可显著减轻香烟所致的气道慢性炎症，减少CSE诱导的AMs和16HBE细胞中的NF-κB活化及LTB4的增加，在一定程度上阻止了炎症进一步发展。
　　3、COPD模型中肺组织和AMs中的TLR2和TLR4表达逐渐增加，并伴随着炎性指标的逐渐增高，提示了TLR2和TLR4可能介导了香烟烟雾所致的AMs和气道上皮细胞的损伤，参与了肺部炎症过程。
　　4、PPAR-γ激动剂15d-PGj2和罗格列酮可下调烟雾所致的AMs和气道上皮细胞的TLR2和TLR4表达增高，而NF-κB、ERK的阻滞剂能协同该调节效应，提示PPAR-γ激动剂可能是通过作用于NF-κB、ERK通路以负调节TLR，从而达到抗炎效应。
　　5、PPARγ可能成为防治COPD新的作用靶点。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 PPARγ在COPD大鼠肺组织中的表达变化及其意义

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 PPAR-γ激动剂对香烟烟雾刺激大鼠肺泡巨噬细胞中TLR2和TLR4表达的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文三 PPAR-γ通过TLR4途径缓解熏烟所致的气道慢性炎症

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 PPAR-γ—治疗COPD的新途径

在学期间科研成绩

致谢

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