山楂种质资源的分子鉴定及创新研究

摘要

山楂属(Crataegus spp.)植物是重要的果树种质资源。本研究以原产于中国的山楂种质资源为试材，探索建立并优化山楂的RAPD分析体系和ISSR分析体系，在此基础上，以在国家果树种质沈阳山楂圃保存的96份山楂属植物资源为试材，利用RAPD标记和ISSR.标记对中国山楂属植物的遗传多样性进行了分析。同时进行了山楂离体再生体系建立和四倍体诱导的研究。主要结果如下： 1.改进的CTAB法(提取缓冲液中含3％的CTAB)和QIAGEN试剂盒法是适宜的山楂总DNA提取方法。改进的CTAB法提取的山楂总：DNA的产率较低，但是纯度较高，OD<,260>/OD<,280>比值在1.638～1.889之间；QIAGEN试剂盒法提取的山楂总DNA的产率和纯度均较高，供试8个样品的总DNA产率均高于100μg/g，OD<,260>/OD<,280>比值在1.758～1.850之间。以改进的CTAB法和QIAGEN试剂盒法提取的山楂总DNA为模板进行RAPD和ISSR扩增，能扩增出多条清晰的谱带，多态性、稳定性、重复性良好。以SDS法提取的山楂总DNA为模板进行RAPD和ISSR扩增，未能扩增出谱带。 2.对循环次数、反应体系中Mg<'2+>浓度、DNA模板质量、Taq DNA聚合酶的来源和浓度等多个影响RAPD反应结果的因子进行了研究，首次建立了优化的山楂属植物RAPD分析体系，即：PCR反应体积为20μl，内含1×PCR反应缓冲液(Promega)，2.0mmol/L MgCl<,2>，0.2 mmol/LdNTP(Promega)，0.3μmol/L引物，0.5 U Taq DNA聚合酶(Tiangen)，50 ng改进的CTAB法或QIAGEN试剂盒法提取的山楂总DNA；扩增程序为94℃30 s；94℃30 s，40℃2 min，72℃3 min，45循环，72℃7：min。根据谱带的多少、多态性、清晰性，从146个RAPD引物中筛选出30个适宜于山楂属植物遗传分析的引物。 3.对退火温度、循环次数、反应体系中Mg<'2+>浓度、DNA模板质量、Taq酶的来源和浓度等影响ISSR反应结果的因子进行了研究，首次建立了优化的山楂属植物ISSR分析体系，即：PCR反应体积为20μl，内含l×PCR反应缓冲液(Promega)，3.0：mmol/LMgCl<,2>，0.2 mmol/L dNTP，0.3 μmol/L引物，0.5 U Taq DNA聚合酶(Tiangen)，50 ng改进的CTAB法或QIAGEN试剂盒法提取的总DNA；扩增程序为94℃3 min；94℃30s，退火温度(通过温度梯度PCR筛选出的适宜温度)1 min，72℃2 min，38循环，72℃7 min。根据谱带的多少、多态性、清晰性，从36个ISSR引物中筛选出13个适宜于山楂属植物遗传分析的引物，其中有8个是基于(GA/CT)n或(AG/TC)n重复序列的在3’端加锚1～2个碱基的ISSR引物。 4.回收了1个山楂RA：PD多态性谱带和16个ISSR多态性谱带，然后对回收的谱带进行克隆和测序，共获得了9个不同的山楂基因组序列。基于解析的山楂序列设计特异引物，成功地将1个RAPD标记和5个ISSR.标记转化成SCAR标记。 5.首次利用分子标记技术对山楂属植物资源进行遗传研究，表明山楂属植物存在较高的遗传多样性。用12个RAPD引物在96份山楂属植物资源上共检测到136个多态性位点，不同山楂种质资源之间的相异系数在0～0.73之间，UPGMA法聚类分析结果显示不同山楂种质资源之间距离系数在0～0.58之间；用13个ISSR引物在96份山楂属植物资源上共检测到130个多态性位点，不同山楂种质资源之间的相异系数在0～0.80之间，UPGMA法聚类分析结果显示不同山楂种质资源之间距离系数在 0～0.65之间。 6.分别绘制了基于RAPD标记和基于ISSR标记的山楂属植物分子系统进化树。基于RAPD标记的山楂属植物聚类结果与基于ISSR标记的聚类结果基本一致。但是与ISSR标记分析结果相比，基于RAPD标记的分类结果更接近于根据形态学特征进行的山楂传统植物学分类结果，RAPD标记更适合于山楂属植物的种内、种间的遗传变异分析。 7.RAPD和ISSR标记的分析结果均表明：在植物学分类上的伏山楂(Cbrettschneideri Sclllleid.)属于山楂(C. pinnatifida Bge.)的一个变种或亚种，而不是一个独立的新种；从辽宁省盖州市熊岳镇引入的表现为黑皮绿肉的‘绿肉山楂’资源属于绿肉山楂(C. chlorosarca Maxim.)；而‘彰武山里红’是一个新种。 8.全面地进行了山楂胚、胚轴和子叶离体再生的研究，结果表明：①山楂未成熟子叶、成熟子叶和子叶叶片的再生不定芽能力明显不同，其中子叶叶片具有较高的再生能力，其不定芽再生频率是成熟子叶的6倍以上，在附加BA和TDZ各1.0 mg/L的MS培养基上，秋金星子叶叶片的不定芽再生频率达到33.3％；②山楂的胚轴分化出不定芽，而胚根只形成了愈伤组织，未能分化不定芽；③花后40 d的山楂幼胚离体培养的成苗率很低，供试的15份资源的幼胚的成苗率都小于20％，而成熟胚离体培养的成苗率较高，在50％以上。 9.用0.5％秋水仙碱+1％二甲基亚砜的混合溶液处理隆化粉肉的成熟胚48 h，然后在SC+IBA 0.1 mg/L+TDZ 1.0 mg/L培养基上诱导芽分化。染色体数目观察结果表明，67个检测植株中有3个是四倍体，变异率达4.5％。

目录

论文说明：缩略词

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摘要

第一章文献综述

1山楂属植物资源的研究和利用

1.1 山楂属植物的起源、演化和分类

1.2 山楂属植物的生产和利用

1.3 中国山楂属植物资源的收集和评价

2分子标记技术及其在果树上的应用

2.1分子标记的概念和特点

2.2分子标记的主要类型

2.3分子标记技术在果树上的应用

3本研究的目的意义

第二章山楂分子标记体系的建立

1材料与方法

1.1植物材料

1.2总DNA提取和检测

1.3 RAPD反应体系

1.4 ISSR反应体系

1.5 PCR产物的检测

1.6 PCR产物的回收、克隆和测序

1.7 SCAR引物设计

1.8 SCAR反应体系

2结果与分析

2.1 山楂总DNA提取方法的比较

2.2山楂RAPD分析体系的建立

2.3 山楂ISSR分析体系的建立和优化

2.4山楂RAPD标记和ISSR标记转化为SCAR标记

3 讨论

3.1影响高质量山楂总DNA提取的因素

3.2 ISSR分析体系的优化策略

4结论

第三章山楂属植物遗传多样性分析

1材料与方法

1.1植物材料

1.2 总DNA提取

1.3 RAPD引物和ISSR引物

1.4 PCR反应及产物检测

1.5数据采集和分析

2结果与分析

2.1 山楂遗传多样性的RAPD分析

2.2 山楂遗传多样性的ISSR分析

3讨论

3.1 楂属的遗传多样性

3.2 山楂属的分类问题

3.3 RAPD标记与ISSR标记在山楂上的应用比较

4结论

第四章山楂离体再生体系的建立及四倍体诱导的研究

1材料与方法

1.1植物材料

1.2外植体接种和培养

1.3秋水仙碱处理

1.4新梢分化

1.5培养基制作

1.6培养条件

1.7染色体计数

1.8统计分析

2结果与分析

2.1 山楂离体再生不定芽

2.2山楂胚培养

2.3 离体诱导山楂四倍体

3讨论

3.1 山楂离体再生能力

3.2植物四倍体的获得途径和价值

4结论

参考文献

附录

攻读学位论文期间发表文章

致谢