甘露糖结合凝集素在IgA肾病中作用及其分子机制的初步研究

摘要

IgA肾病是全世界范围内最常见的肾小球肾炎，占原发性肾小球肾炎的20-45％。IgA肾病临床及病理表现多种多样，超过三分之一的患者在发病后20-25年可进展为终末期肾脏病。因此寻找可靠的标记物来科学评估IgA肾病的严重程度和预后以及探讨其疾病进展机制显得至关重要。
　　 甘露糖结合凝集素(Mannose binding lectin，MBL)是一种进化保守、可循环的胶原凝集素，主要由肝脏合成，存在于人体血清中，具有C1q的胶原主茎和凝集素结构域。MBL与C1q具有同源结构，能与不同微生物表面的糖基结合;还可与免疫球蛋白及免疫复合物结合。MBL在人体内发挥多种作用，参与多种疾病的发生与进展，如在感染性疾病及抵抗病原体的过程中发挥保护性的作用;在系统性红斑狼疮、皮肌炎、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病中也发挥重要的调节作用;甚至还与糖尿病、缺血再灌注损伤以及严重的冠状动脉疾病和/或斑块的形成有关。但MBL在IgA肾病中的作用及机制尚未明确。
　　 近年来尿液标本因其无创、简单易得并能直接反映肾小球疾病而广受关注。既往有研究显示造影剂肾病患者尿液MBL水平可明显升高，但迄今为止尿液MBL水平在IgA肾病中的意义尚无报道。本研究中，我们将探讨尿液MBL水平在评估IgA肾病疾病严重程度以及判断其预后方面的重要意义。
　　 另有研究发现部分IgA肾病患者肾组织中存在MBL沉积。但是关于MBL在肾组织中沉积的意义尚未得到统一的结论。本研究中我们将评价肾小球MBL沉积在评估IgA肾病疾病严重程度中的意义，并根据随访数据探讨MBL沉积与肾脏缓解之间的关系。
　　 IgA肾病主要的病理特点是系膜细胞及系膜基质的增生，免疫病理表现为IgA（主要是IgA1）并常伴有补体成分沉积于肾小球系膜区。我们应用共聚焦显微镜观察MBL在肾组织中的定位，结果发现MBL与纤连蛋白（系膜细胞标记物）共同沉积于肾小球系膜区。
　　 肾小球系膜细胞是一种功能活跃的肾小球固有细胞，它能够维持肾小球毛细血管网结构的完整性;通过其收缩功能，改变血流量和滤过面积来调节肾小球滤过率;分泌细胞外基质蛋白、生长因子、细胞因子等生物活性物质;摄取免疫复合物及大分子物质等。
　　 NF-κB是介导细胞内信号转导的重要转录因子，参与免疫调节、炎症反应和细胞生长，其在调节肾小球系膜细胞的活化及肾脏的炎症损伤中居于核心地位。NF-κB以同源或异源二聚体的形式广泛存在于真核细胞内。p65是NF-κB的亚基，通常情况下通过检测p65的表达水平来判定NF-κB是否活化。
　　 根据前期的研究结果，我们推测MBL可能在肾组织局部与系膜细胞发生相互作用，这种相互作用可能与IgA肾病的进展有关。为验证这一假设，我们以人肾系膜细胞为工具细胞，探讨MBL对人肾系膜细胞生物学行为的影响，并进一步研究MBL与NF-κB信号转导通路的关系，从而为明确IgA肾病疾病进展的机制提供线索和依据。
　　 实验材料及方法：
　　 连续入选肾活检证实的原发性IgA肾病患者，年龄及性别匹配的健康体检者作为正常对照。ELISA法检测IgA肾病患者尿液MBL水平，收集并记录患者的一般临床、病理资料并进行规律随访，分析IgA肾病患者尿液MBL水平与临床和病理预后因子以及肾脏缓解之间的关系。
　　 连续入选肾活检证实的原发性IgA肾病且具有充分肾组织（切片中含5个或以上肾小球）的患者。免疫荧光法检测肾组织中MBL的沉积;为明确MBL在肾组织中沉积的部位，进行MBL和纤连蛋白（一种系膜细胞标记物）的免疫荧光双染，共聚焦显微镜进行观察。收集并记录患者的一般临床及病理资料，分析IgA肾病患者肾组织MBL沉积情况与临床和病理预后因子以及肾脏缓解之间的关系。
　　 MTT试验检测系膜细胞的生长情况。应用30％体积分数的去MBL正常人血清、去MBL的IgA肾病患者血清以及加入不同浓度rMBL（0.2μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml）的IgA肾病患者血清孵育人肾系膜细胞72小时，之后行MTT检测。3次实验结果用于统计学分析。
　　 流式细胞术检测细胞周期及凋亡情况。应用30％体积分数的去MBL正常人血清、去MBL的IgA肾病患者血清和加入1μg/ml rMBL的IgA肾病患者血清孵育人肾系膜细胞72小时，流式细胞术检测三组系膜细胞周期及凋亡情况。3次实验结果用于统计学分析。
　　 对rMBL（1μg/ml）+IgA肾病血清刺激后的系膜细胞进行MBL的免疫荧光染色，通过激光扫描共聚焦显微镜进行分层扫描，以明确MBL在系膜细胞的定位。
　　 免疫印迹法检测细胞周期关键蛋白Cyclin B1、Cyclin D1及凋亡相关蛋白caspase、Bcl-2的表达，以进一步探讨MBL对系膜细胞细胞周期及凋亡的影响。
　　 免疫印迹法检测p65的表达。ELISA法检测系膜细胞上清液中MCP-1、IL-6的蛋白浓度，3次实验结果进行统计学分析。
　　 结果：
　　 1、IgA肾病患者(n=162)尿液MBL水平明显高于正常对照组(n=50)。
　　 2、伴有高血压的IgA肾病患者尿MBL水平明显高于无高血压的IgA肾病患者;尿MBL水平与血肌酐、尿蛋白、血清C4水平呈正相关，与eGFR呈负相关。
　　 3、随着Lee分级病理表型加重，尿MBL水平明显升高;存在明显系膜细胞增生、肾小球节段硬化、内皮细胞增生以及小管间质损伤者，尿MBL水平明显升高。
　　 4、随访数据表明肾脏未缓解的IgA肾病患者尿MBL水平明显高于肾脏缓解者。
　　 5、131例IgA肾病患者肾组织用于MBL免疫荧光染色，其中45例(34.35％)肾组织中存在MBL沉积，表现为弥漫或节段性沉积。共聚焦显微镜检发现MBL与纤连蛋白共同沉积于肾小球系膜区。
　　 6、与不存在MBL沉积者相比，存在MBL沉积的IgA肾病患者血肌酐、尿蛋白及高血压患者比例更高，但eGFR及血清白蛋白水平明显降低。
　　 7、随着Lee分级病理表型的加重，肾小球MBL沉积的患者比例明显增加;根据牛津分级标准，存在MBL沉积的患者病理改变也更重，表现为更多患者存在明显的系膜细胞增生、肾小球节段硬化、内皮细胞增生以及小管间质损害。
　　 8、存在肾小球MBL沉积的患者肾脏缓解率明显低于无MBL沉积者。
　　 9、MTT试验检测细胞的生长情况，结果发现rMBL（1μg/ml）+IgA肾病患者血清孵育的人肾系膜细胞OD值出现比较明显的下降，提示此时系膜细胞的生长受到抑制。
　　 10、激光扫描共聚焦显微镜分层扫描结果显示MBL可通过细胞膜进入细胞浆。
　　 11、流式细胞术检测细胞周期，结果显示正常血清组、IgA肾病血清组及rMBL（1μg/ml）+IgA肾病血清组之间不同细胞周期的系膜细胞比例没有明显差别。免疫印迹法检测细胞周期关键蛋白Cyclin B1和Cyclin D1的表达，结果显示三组系膜细胞Cyclin B1和Cyclin D1的表达没有明显差异。
　　 12、流式细胞术（Annexin（V）/PI双染法）检测上述细胞凋亡情况，结果显示rMBL（1μg/ml）+IgA肾病血清组细胞早期凋亡率明显高于正常血清组及IgA肾病血清组。免疫印迹法检测果显示三组细胞中caspase均无表达， Bcl-2在rMBL（1μg/ml）+IgA肾病血清组的系膜细胞中表达减弱，在正常血清组与IgA肾病血清组无明显差别。
　　 13、与正常血清组及IgA肾病血清组相比，rMBL（1μg/ml）+IgA肾病血清组p65表达明显增强。rMBL（1μg/ml）+IgA肾病血清组系膜细胞上清液中MCP-1、IL-6的蛋白浓度明显高于IgA肾病血清组和正常血清组，IgA肾病血清组也明显高于正常血清组。
　　 结论：
　　 1、尿MBL水平能够反映IgA肾病的严重程度，并与肾脏预后有关，因而可望成为判断IgA肾病预后的可靠的生物标记物。
　　 2、存在肾小球MBL沉积的IgA肾病患者临床及病理表现更为严重，肾脏的缓解率更低。肾小球MBL沉积可望成为判断IgA肾病预后的一个重要的病理预测因子。
　　 3、MBL能够抑制体外人肾系膜细胞的生长，促进其发生凋亡;并可能通过激活细胞内NF-κB信号转导通路，促进炎症因子的产生，导致更加严重的肾损害。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 尿甘露糖结合凝集素水平是IgA肾病重要的预后因子

前言

研究对象与方法

结果

讨论

结论

论文二 肾小球甘露糖结合凝集素的沉积是IgA肾病重要的预后因子

前言

研究对象与方法

结果

讨论

结论

论文三 甘露糖结合凝集素对人肾系膜细胞的作用及其分子机制的初步研究

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述

在学期间科研成绩

致谢

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