茶多酚和盐酸美金刚胺对甲基汞致大鼠神经毒性的防护作用及其分子机制的研究

摘要

前言：
　　甲基汞(methylmercury，MeHg)是严重危害人类健康的环境蓄积性污染物，具有强烈的神经毒性作用。MeHg脂溶性强，易于穿透生物膜，进入机体后主要与巯基结合，以半胱氨酸-甲基汞复合物的形式，在中性氨基酸的转运下透过血脑屏障在脑中蓄积。
　　虽然人们致力于研究MeHg的神经损害多年，但其神经毒性机制仍未被完全阐明。有报道称MeHg的神经毒性主要与其所致脑氧化损伤及Glu代谢转运障碍有关，二者的相互作用又进一步增大了其神经毒性。有研究表明MeHg可使脑中ROS形成率显著升高，ROS是细胞过氧化损伤的起始因子，细胞内ROS生成增加以及抗氧化体系的抑制共同导致细胞氧化损伤。Glu在突触间隙中是通过受体的灭活与Glu的重摄取而达到平衡状态。Glu的重摄取依赖于星形胶质细胞上的谷氨酸转运体，重摄取进入星形胶质细胞的Glu会被GS转化为Gln，以保持突触间隙正常的Glu浓度。有研究提示MeHg可能会干扰Glu重摄取和代谢，而这种效应可能与MeHg导致的氧化损伤有关。此外，突触间隙内的Glu与突触后神经元的Glu受体（主要是NMDA受体）相结合，向下传导细胞信号。突触间隙内过量的Glu会过度激活NMDA受体，Ca2+大量内流。有研究提示神经元内Ca2+超载可能会通过一系列反应促使线粒体ROS生成增加从而加剧氧化损伤，但其机制还不是十分明确。
　　茶多酚(tea polyphenols，TP)是一种天然抗氧化剂，其含有的大量酚羟基能够清除体内过量的活性氧自由基，抑制过氧化反应。盐酸美金刚胺(memantine，MEM)是一种低亲和力、非竞争性的NMDA受体拮抗剂，能够抑制NMDA受体过度激活而引起的Ca2+内流，在临床上可用于阿尔茨海默病的治疗。但是，目前应用TP和MEM预处理来拮抗MeHg神经毒性的研究还鲜有报道。
　　本研究拟通过整体动物实验与体外细胞培养相结合的方法，首先建立MeHg短期重复暴露动物模型，研究MeHg致大鼠大脑皮质氧化损伤和Glu代谢转运障碍，以及TP和MEM的防护作用;其次，建立星形胶质细胞染毒模型，研究MeHg致星形胶质细胞氧化损伤和Glu代谢转运障碍，以及TP的防护作用;最后，建立神经元染毒模型，研究MeHg致神经元NMDA受体表达异常及钙超载，以及TP和MEM的防护作用，深入探讨MeHg所致氧化损伤与Glu代谢转运障碍介导的兴奋性毒性之间的联系，为MeHg中毒的防治提供实验依据。
　　材料与方法：
　　一、TP和MEM预处理对MeHg致大鼠大脑皮质氧化损伤及Glu代谢转运障碍的防护作用
　　由中国医科大学实验动物中心提供的实验用清洁级Wistar大鼠180只，体重170±10克，雌雄各半，分为两个批次，每个批次90只。第一批大鼠按体重随机分为5组，每组18只。第1组为对照组，第2组为TP对照组，第3、4组分别为低、高剂量染汞组，第5组为TP预处理组。第1、3、4组灌胃生理盐水，第2、5组灌胃1mmol/kgTP。2h后，第1、2组腹腔注射生理盐水，第3、4、5组分别腹腔注射4、12、12μmol/kgMeHgCl，灌胃及注射容量均为5ml/kg。连续染毒与预处理4周，染毒每周5次，TP预处理隔日1次。第二批大鼠分组方式与第一批相同，第1、3、4组皮下注射生理盐水，第2、5组皮下注射5μmol/kgMEM。2h后，第1、2组腹腔注射生理盐水，第3、4、5组分别腹腔注射4、12、12μmol/kgMeHgCl。连续染毒与预处理4周，染毒每周5次，MEM预处理隔日1次。最后一次染毒24h后，每组取6只大鼠麻醉，处死，切取枕叶大脑皮质，应用冷原子吸收法测定大脑皮质内汞含量。其余大脑皮质根据检测指标的不同，制备成不同浓度的匀浆液，应用比色法测定大脑皮质GSH、MDA、protein sulfhydryl、protein carbonyl、Glu和Gln的含量，以及SOD、GSH-Px、GS、PAG、Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活力。各组再取4只大鼠，制备大脑皮质单细胞悬液，应用流式细胞术测定大脑皮质细胞内ROS含量及细胞凋亡率、双波长荧光比色法测定游离Ca2+浓度。各组另取4只大鼠，提取大脑皮质总RNA及蛋白，应用Real-time PCR及Western blotting法检测Nrf2及其下游基因和蛋白（HO-1和γ-GCS）、NMDA受体(NR1、NR2A、NR2B)及谷氨酸转运体（GLAST和GLT-1）mRNA和蛋白表达水平。各组其余4只大鼠，麻醉后暴露心脏，4％多聚甲醛灌流固定后取大脑皮质，免疫组化法检测8-OHdG含量，HE染色及透射电镜观察组织细胞病理学改变。
　　二、TP预处理对MeHg致大鼠大脑皮质星形胶质细胞氧化损伤及Glu代谢转运障碍的防护作用
　　进行星形胶质细胞原代及传代培养，应用GFAP免疫细胞化学反应进行鉴定，阳性率达90％以上后进行实验。通过MTT法测定细胞活力以及LDH漏出分析，观察MeHg(0～20μmol/L)处理6～30h后细胞毒性的变化和TP(50～400μmol/L)预处理1～12h后的防护作用，并选择适宜且有代表性的MeHg处理和TP预处理的剂量和时间，进行星形胶质细胞形态学观察，并应用前述方法测定细胞内NPSH含量，ROS、Ca2+及细胞凋亡水平，GS和Na+-K+-ATPase活力，Nrf2及其下游基因蛋白HO-1、γ-GCS的mRNA和蛋白表达水平，GS、GLAST及GLT-1的mRNA和蛋白表达水平。
　　三、TP和MEM预处理对MeHg致大鼠大脑皮质神经元NMDA受体表达异常及钙超载的防护作用
　　进行原代神经元培养，应用NSE免疫荧光染色进行鉴定，阳性率达90％以上后进行实验。通过MTT法及LDH漏出分析法，观察MeHg（0～2μmol/L）处理0.5～12h后细胞毒性的变化，以及TP(5～40μmol/L)和MEM(2.5～20μmol/L)预处理0.5～6h后的防护作用，并选择适宜且有代表性的MeHg处理、TP和MEM预处理的剂量和时间，进行神经元形态学观察，并应用上述方法测定NMDA受体(NR1、NR2A和NR2B)的mRNA和蛋白表达水平、细胞内游离Ca2+含量、钙蛋白酶活力、ROS水平、Na+-K+-ATPase及Ca2+-ATPase活力。
　　结果：
　　一、TP和MEM预处理对MeHg致大鼠大脑皮质氧化损伤及Glu代谢转运障碍的防护作用
　　与对照组相比，随着染MeHg剂量的增加，大鼠大脑皮质内Hg含量逐渐升高，GSH含量、SOD和GSH-Px活力、protein sulfhydryl含量逐渐降低，细胞内ROS水平逐渐升高，MDA、protein carbonyl及8-OHdG含量逐渐升高，Na+-K+-ATPase及Ca2+-ATPase活力逐渐降低，Nrf2、HO-1及γ-GCSmRNA和蛋白表达水平逐渐升高，Glu含量逐渐升高，Gln含量逐渐降低，GS活力逐渐降低，PAG活力逐渐升高，NMDA受体mRNA和蛋白表达水平逐渐下降，GLAST和GLT-1mRNA和蛋白表达水平逐渐降低，细胞内游离Ca2+含量和细胞凋亡水平逐渐升高，大脑皮质组织形态及细胞超微结构损伤程度逐渐加重。与12μmol/kgMeHg组比较，TP和MEM预处理后，大脑皮质氧化损伤及Glu代谢转运障碍得到不同程度的缓解，大脑皮质组织及细胞损伤程度减轻，但大脑皮质内Hg含量未见显著性降低。
　　二、TP预处理对MeHg致大鼠大脑皮质星形胶质细胞氧化损伤及Glu代谢转运障碍的防护作用
　　通过MTT法和LDH漏出分析观察MeHg对星形胶质细胞是否具有毒性作用。结果表明随着MeHg处理剂量和时间的增加，星形胶质细胞活力逐渐下降，LDH漏出逐渐增加，并呈现一定的剂量和时间依赖性的效应关系。在10μmol/LMeHg剂量水平上，处理24h后，相对细胞活力为52.3％，大约达到半数抑制浓度，给予不同浓度及时间的TP预处理后，通过MTT法及LDH漏出分析，发现与10μmol/LMeHg组比较，在200和400μmol/LTP预处理6和12h后，星形胶质细胞活力显著升高，LDH漏出显著降低，且两个剂量之间以及两个处理时间之间未见明显差异，故在后续实验中我们选择10μmol/LMeHg处理24h作为MeHg处理剂量和时间，选择50、100和200μmol/L三个剂量组预处理6h作为TP预处理剂量和时间。与对照组相比，10μmol/LMeHg组星形胶质细胞出现严重的形态学损伤，细胞内NPSH含量显著降低，ROS水平显著升高，GS及Na+-K+-ATPase活力显著降低，细胞内Ca2+水平显著升高，细胞凋亡水平显著升高，Nrf2、HO-1及γ-GCSmRNA和蛋白表达水平均显著升高，GS、GLAST及GLT-1mRNA和蛋白表达水平均显著降低。与10μmol/LMeHg组相比，随着TP预处理剂量的升高，上述损伤均得到不同程度的缓解，并呈现一定的剂量效应关系。
　　三、TP和MEM预处理对MeHg致大鼠大脑皮质神经元NMDA受体表达异常及钙超载的防护作用
　　通过MTT法和LDH漏出分析观察MeHg对神经元是否具有毒性作用。结果表明随着MeHg处理剂量和时间的增加，神经元细胞活力逐渐下降，LDH漏出逐渐增加，并呈现一定的剂量和时间依赖性的效应关系。我们采用与星形胶质细胞相同的方法，确定1μmol/LMeHg处理6h（细胞活力为53.15％）为MeHg的暴露剂量和时间，5、10、20μmol/LTP预处理3h，2.5、5、10μmol/LMEM预处理3h分别为TP和MEM的预处理剂量和时间。与对照组相比，1μmol/LMeHg组神经元出现严重的形态学损伤，NR1、NR2A和NR2BmRNA表达水平均显著升高，NR1和NR2A蛋白表达水平显著升高，细胞内游离Ca2+含量显著升高，钙蛋白酶活力显著升高，ROS水平显著升高，Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活力显著降低。与1μmol/LMeHg组相比，随着TP和MEM预处理剂量的增加，神经元损伤及细胞毒性得到不同程度的减轻，并呈现一定的剂量效应关系。
　　结论：
　　1、MeHg可导致大鼠大脑皮质氧化损伤和Glu代谢转运障碍，TP和MEM预处理对其具有一定程度的保护作用。
　　2、MeHg可对星形胶质细胞产生毒性作用，并能够导致星形胶质细胞氧化损伤和Glu代谢转运障碍，TP预处理能够减轻这种损伤。
　　3、MeHg可对神经元产生毒性作用，导致NMDA受体表达异常，细胞内钙超载，并加剧神经元氧化损伤，TP和MEM预处理对其具有一定的防护作用。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 茶多酚和盐酸美金刚胺对甲基汞致大鼠大脑皮质氧化损伤及谷氨酸代谢转运障碍的防护作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 茶多酚对甲基汞致大鼠大脑皮质星形胶质细胞氧化损伤及谷氨酸代谢转运障碍的防护作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文三 茶多酚和盐酸美金刚胺对甲基汞致大鼠大脑皮质神经元NMDA受体表达异常及钙超载的防护作用

前言

材料与方法

结果

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结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 甲基汞致神经毒性效应及其作用机制研究进展

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