基质细胞衍生因子1-α和心脏去细胞外基质介导骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死

摘要

前言
　　心肌梗死等心血管疾病是一种严重威胁人类生命健康的疾病。随着生活方式的变化，我国冠心病发病率逐年升高。目前临床治疗冠心病有三大方法:药物保守治疗、经皮冠脉支架介入、冠脉搭桥手术。因为心肌的再生能力几乎没有，以上无论哪种方法都无法使梗死心肌恢复收缩功能达到治愈的效果。由于干细胞的多向分化潜能以及无限增殖分裂等特性，近年来，利用干细胞治疗心肌梗死已经成为临床科研的热门领域，以及具有广阔前景的治疗选择。干细胞种类繁多，目前最有希望应用于临床的是骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)和心脏干细胞(cardiacstemcells，CSCs)[1，2,3]。
　　BMSCs是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多相分化潜能的成体干细胞。由于BMSCs不易引起免疫排斥，易于外源基因的导入和表达，而同时又具有比其他间充质干细胞来源更加广泛、更加易于分离培养、可自体移植等特点，BMSCs治疗越来越受到学者们的青睐，被认为是即将被引入临床治疗的最佳干细胞。但是由于移植的BMSCs局部存活细胞少以及向心肌细胞分化能力低，使得BMSCs应用效果受限。解决这一难题，成为干细胞治疗心梗的关键。
　　基质细胞衍生因子（Stromalcellderivedfactor1，SDF-1）是一种G蛋白偶联受体的配体，SDF-1为CXC家族成员。在体内SDF-1的形式主要有两种分别为SDF-1α和SDF-1β，以SDF-1α为主。心肌组织损伤后，外周血中循环干细胞数目明显增多，外周血中的循环干细胞随着血液循环可到达各个组织器官，而最终会在哪个组织器官栖息、增殖分化与SDF-1的作用有关。已有研究证实SDF-1能够促进骨髓干细胞的动员，增强细胞的运动能力和细胞黏附到纤维蛋白、间质和内皮细胞的作用[4]。
　　但作为细胞因子的SDF-1α并不稳定，单独应用时，半衰期短，其易被蛋白酶水解，其蛋白水解活性以及在梗死区快速的扩散限制了其生物作用，如果能将SDF-1α控释，使其在梗死区达到稳定的浓度进而延长其针对BMSCs作用时间，这可能是基质细胞衍生因子辅助BMSCs治疗的一个关键。
　　目前已有多种生物材料应用于传递生物活性物质研究，纤维蛋白[5，6]、胶原[7，8]人工基底膜[9，10]、藻朊酸盐[11]、自组装肽[12]、壳聚糖[13]等。但这些材料都不能充分的还原天然ECM的结构及化学组成[14]。近期已经开发出来源于自体细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）的脱细胞支架组织并应用于细胞工程学[15-18]。这种材料单独注射于小动物的梗死区域后，能够促进细胞的渗透并显示出心梗后的细胞保护作用[19,20]。通过多价粘合剂的肝素介导，ECM与细胞因子共价结合，使其可以作为载体捕捉及释放细胞因子，另外，心脏脱细胞外基质作为模拟原生心肌ECM生物及化学特性的最佳材料[19]，这种渗透性、纤维性的支架组织可以促进缺血区域的渗透性和血管再生[21]。
　　由此，本研究将利用心脏脱细胞外基质作为缓释载体，采用体外和体内实验，分三个部分，以脱细胞基质缓释基质细胞衍生因子-1对BMSCs作用作为主要研究内容，研究BMSCs参与心肌再生的机理，尝试不同处理因素干预BMSCs，以增强BMSCs移植的治疗效果，改进干细胞治疗方法。
　　关键词:骨髓间充质干细胞;基质细胞衍生因子;脱细胞基质;肝素化;缓释;急性心肌梗死;
　　第一部分脱细胞基质缓释基质细胞衍生因子-1的体外研究
　　目的
　　用“去细胞化”制备心脏细胞外基质并进行SDF-1α修饰，通过观察SDF-1α的释放规律分析评价心脏脱细胞细胞外基质预载SDF-1α后的缓释情况。
　　方法
　　离体心脏取自健康成年大耳兔(2.0±0.5kg)，采用1％十二烷基硫酸钠(Sodiumdodecylsulfate，SDS)循环灌注的方法得到脱细胞心脏纤维骨架并制成匀浆。利用含有2％肝素、2％EDC及1.2％羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液（2-N-morpholoinolethanesulfonicacid，MES）中行肝素固化，进行SDF-1α修饰。利用ELISA测定3h、6h、24h、96h、168h液体浓度绘制释放曲线。
　　结果
　　通过ELISA计算不同时间点心脏脱细胞释放SDF-1α量，绘制出一条释放曲线。
　　结论
　　经过ELISA绘制曲线证实，心脏脱细胞外基质通过肝素化摄取并释放SDF-1α，其性质稳定。
　　第二部分脱细胞基质缓释SDF-1α联合骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死的效果观察
　　目的
　　动物在体实验采用SDF-1α预载肝素固化的心脏脱细胞细胞外基质与BMSCs共同作用，干预梗死心肌，观察其对梗死心肌的治疗效果，进一步验证体外实验结果。
　　方法
　　选用日本大耳白兔，雌雄不拘，体重2.5±0.5kg，于冠脉前降支中、远端1/3交界处阻断，反复缺血预适应3次后彻底结扎，局部心肌颜色变为暗紫色。将实验分四组，第一组为单纯心梗模型建立的对照组;第二组SDF-1α+脱细胞基质组;第三组BMSCs组;第四组SDF-1α+脱细胞基质+BMSCs组。每组术后6周心脏超声进行心脏机械功能分析并取移植区域组织，采用免疫荧光染色，共聚焦显微镜成像分析移植细胞表达cTNT、GATA4等抗原确定心肌细胞分化。比较分析各组干细胞分化差异。
　　结果
　　心肌梗死后，免疫荧光及Masson染色显示，BMSCs伴随脱细胞外基质缓释SDF-1α移植情况下，梗死区凋亡细胞明显减少，且BMSCs表达cTNT及GATA等明显升高，联合治疗组LVEF亦较对照组升高(p＜0.05)。
　　结论
　　本研究在体证明了联合缓释SDF-1α和BMSCs移植促进局部BMSCs存活、抑制凋亡和向心肌细胞分化，不仅限制了心梗后左室扩张，同样促进心功能明显改善。
　　第三部分脱细胞基质与基质细胞衍生因子-1协同作用骨髓间充质干细胞机制的研究
　　目的
　　在体外实验中观察SDF-1α与细胞外基质与BMSCs联合应用对骨髓间充质干细胞存活、增殖能力、迁移、分化等影响，揭示其在骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死中的作用机制;
　　方法
　　体外观察心脏脱细胞基质与SDF-1α对BMSCs的协同作用。体外增殖、迁移、分化和凋亡评价:用脱细胞基质、SDF-1α、脱细胞基质+SDF-1α刺激BMSCs，利用阿尔玛蓝法检测细胞增殖;transwell小室观察细胞迁移;采用Westernblot及免疫荧光等技术测定cTNT、GATA4等评价心肌细胞分化;利用缺氧诱导BMSCs凋亡，使用流式细胞仪(AnexinⅤ/PI)双染定量检测。
　　结果
　　心脏脱细胞外基质缓释SDF-1α组的骨髓间充质干细胞增殖明显，比对照组、SDF、单纯心脏脱细胞外基质组有明显差异(p＜0.05)。针对骨髓间充质干细胞缺氧诱导凋亡后行流式细胞仪检测，相对对照组，心脏脱细胞外基质缓释SDF-1α可以明显抑制骨髓间充质干细胞的早期及晚期凋亡(p＜0.01)并且在transwell实验中提高其迁移数量，单纯心脏脱细胞外基质结果相反，其会促进骨髓间充质干细胞缺氧诱导的凋亡(p＜0.05)以及抑制骨髓间充质干细胞的迁移。体外免疫荧光实验中，只有心脏脱细胞外基质缓释SDF组观察到TNI荧光的阳性结果。
　　结论
　　心脏脱细胞外基质缓释SDF-1α与骨髓间充质干细胞共同培养，可以明显提高骨髓间充质干细胞的增殖、抗缺氧能力、迁移以及分化。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

论文一 脱细胞基质缓释基质细胞衍生因子-1的体外研究

前言

材料

方法

结果

讨论

结论

参考文献

论文二 脱细胞基质缓释SDF-1α联合骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死的效果观察

前言

材料

方法

结果

讨论

结论

参考文献

论文三 脱细胞基质与基质细胞衍生因子-1协同作用骨髓间充质干细胞机制的研究

前言

材料

方法

结果

讨论

结论

参考文献

结论

本研究创新性的自我评价

综述 SDF-1与BMSCs联合移植治疗心肌梗死的研究进展

致谢

个人简历