OrexinA及其受体1干预鼠脂肪细胞PPAR-γ2及GLUT4mRNA表达和TG合成的分子机制研究

摘要

增食欲素(Orexin)是1998年发现的一类神经肽，包括orexinA和B。Orexin有二种受体亚型，均属于G蛋白偶联受体，Orexin1受体(OX1R)、Orexin2受体(OX2R)。其中OX1R是首先被发现的，且与orexin A有较高的亲和性。大量的资料显示，orexinA及其受体参与多种生理功能的调节，包括摄食、能量平衡、睡眠/觉醒、呼吸、学习与记忆、食物与药物成瘾、应激、胃肠道功能等。最近的研究表明，肥胖患者血中Orexin A明显低于正常人，并且与年龄、BMI呈负相关;还有研究显示orexin过表达或应用药理学诱导orexin受体表达可以阻止高脂饮食大鼠肥胖和胰岛素抵抗的发展，这些研究提示orexinA与肥胖及胰岛素抵抗密切相关。
　　肥胖是2型糖尿病主要的危险因素。脂肪组织不仅是体内主要的能量储存器官，而且是重要的内分泌器官;不仅对机体的能量代谢平衡至关重要，还与胰岛素抵抗、2型糖尿病的发生有密切关系。已有研究证实3T3-L1细胞（前脂肪细胞）和脂肪细胞均存在orexin受体。并且有研究表明Orexin A可以提高脂肪细胞对葡萄糖的摄取率及阻止甘油的释放;orexinA能够激活人肾上腺细胞ERK1/2，JNK和p38 MAPK信号途径。研究orexinA对脂肪细胞糖脂代谢功能的影响，对于研究肥胖和胰岛素抵抗发生发展的过程具有重要的意义。本课题拟通过高脂饮食诱导建立肥胖与胰岛素抵抗(Insulin Resistance，IR)大鼠模型，检测大鼠脂肪组织中OX1R的表达，以及orexinA对脂肪细胞PPAR-γ2表达的影响，并诱导3T3-L1细胞分化为分化的脂肪细胞后，研究orexinA对分化的脂肪细胞的GLUT4表达和脂质合成功能的影响及可能的分子机制，旨在探讨orexinA在肥胖及IR中的相关作用及生物学机制。
　　实验方法：
　　一、Orexin A及OX1R在高脂饮食诱导的肥胖相关胰岛素抵抗大鼠表达中的研究
　　选择4周龄SPF级雄性SD大鼠30只，随机分为2组:正常对照组(NC组)、高脂饮食组(HF组)。NC组予以普通颗粒饲料、HF组予以高脂饲料，饲养8周。8周后，各组大鼠称取体重，每组随机选取5只进行高胰岛素-正常葡萄糖钳夹实验验证胰岛素抵抗大鼠模型的建立。其余大鼠心脏取血，分别进行血糖、血脂、胰岛素、orexin A水平测定。处死大鼠后，摘取网膜及附睾周围脂肪组织称重，留取脂肪组织，应用western blot检测脂肪组织OX1R蛋白表达。采用SPSS13.0统计软件进行分析统计，P＜0.05表示有统计学意义。
　　二、Orexin A及OX1R对脂肪细胞PPAR-γ2、GLUT4 mRNA表达和TG含量的影响
　　体外培养3T3-L1细胞，分别加入不同浓度的orexin A和/或OX1R特异性抑制剂(SB334867)进行干预，RT-PCR技术检测PPAR-γ2 mRNA表达;分化3T3-L1细胞9天后，分别予以Orexin A10-7M、10-8M、10-9M以及OX1R抑制剂孵化细胞，RT-PCR技术检测PPAR-γ2mRNA和GLUT4 mRNA表达，甘油三酯试剂盒测定细胞内甘油三酯含量。
　　三、Orexin A及OX1R调节脂肪细胞内ERK、JNK、p38信号通路蛋白的研究
　　体外诱导分化的脂肪细胞，分别加入10-7M浓度的Orexin A和/或ERK、JNK、p38抑制剂及OX1R特异性抑制剂进行干预，western-blot检测ERK、JNK、p38总蛋白及磷酸化蛋白的表达;RT-PCR检测GLUT4 mRNA表达，甘油三酯试剂盒测定细胞内甘油三酯含量。
　　实验结果：
　　一、Orexin A及OX1R在高脂饮食诱导的肥胖相关胰岛素抵抗大鼠中的表达
　　1、钳夹技术及评价指标
　　实验中高脂组大鼠体重、空腹血糖(FBG）、血胰岛素(FIns)高于对照组;高脂组大鼠平均GIR60-120明显低于对照组;而高脂组大鼠平均BG60-120高于对照组。
　　2、肥胖胰岛素抵抗大鼠血清生化指标及血清胰岛素的变化
　　高脂组大鼠血糖、血胰岛素、血甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)水平均高于对照组。
　　3、肥胖胰岛素抵抗大鼠血orexin A及脂肪组织OX1R的变化
　　高脂组大鼠血Orexin A水平及脂肪组织的OX1R表达均低于对照组，并且OX1R水平与体脂含量、Lee's指数、TG、TC、血胰岛素水平成负相关。
　　二、Orexin A及OX1R对脂肪细胞PPAR-γ2、GLUT4 mRNA表达和TG含量的影响
　　1、Orexin A对3T3-L1细胞PPAR-γ2 mRNA表达的影响
　　不同浓度的Orexin A均可诱导3T3-L1细胞PPAR-γ2mRNA的表达，其中10-7M和10-8M组效应具统计学意义;并且PPAR-γ2mRNA表达受OX1R抑制剂抑制。
　　2、OrexinA对分化的脂肪细胞PPAR-γ2mRNA表达的影响
　　不同浓度的OrexinA均可诱导分化的脂肪细胞PPAR-γ2mRNA的表达，其中10-7M和10-8M组效应具统计学意义;并且PPAR-γ2mRNA表达受OX1R抑制剂抑制。
　　3、Orexin A对分化的脂肪细胞GLUT4 mRNA表达及TG含量的影响
　　不同浓度的OrexinA可上调分化的脂肪细胞GLUT4mRNA表达及增加TG含量，其中10-7 M浓度时的orexinA刺激效应最显著;加入OX1R特异性抑制剂后，orexinA对分化的脂肪细胞GLUT4mRNA的表达及TG合成受到抑制。
　　三、Orexin A及OX1R调节脂肪细胞内ERK、JNK、p38信号通路蛋白的研究
　　1、Orexin A通过MAPK信号途径(ERK1/2、JNK、P38)对分化的脂肪细胞GLUT4表达的影响
　　在培养液中加入JNK抑制剂、p38抑制剂分别可抑制10-7M浓度OrexinA诱导的JNK、p38磷酸化蛋白水平及GLUT4 mRNA的表达，当再加入OX1R抑制剂时这种抑制作用增强。加入ERK抑制剂(U0126)或/和OX1R抑制剂后，OrexinA诱导的ERK磷酸化蛋白水平及GLUT4 mRNA的表达没有明显的抑制，无统计学意义。
　　2、Orexin A通过MAPK信号途径(ERK1/2、JNK、P38)对分化的脂肪细胞TG合成的影响
　　在培养液中加入ERK抑制剂、JNK抑制剂、p38抑制剂或/和OX1R抑制剂分别可抑制10-7M浓度Orexin A诱导的ERK、JNK、p38磷酸化蛋白水平及TG含量。
　　结论：
　　1、高脂饮食喂养SD大鼠8周后，可建立肥胖相关胰岛素抵抗大鼠动物模型;肥胖相关胰岛素抵抗大鼠血OrexinA水平降低;脂肪组织OX1R蛋白表达水平降低，表明orexinA及OX1R可能参与脂肪组织功能的调节。
　　2、Orexin A通过OX1R介导可上调3T3-L1细胞PPAR2 mRNA水平，并上调分化的3T3-L1细胞PPARγ2 mRNA水平，提示Orexin A可能在前脂肪细胞的分化中发挥一定作用。
　　3、OrexinA通过OX1R介导激活MAPK(ERK、JNK、P38)信号途径上调分化的3T3-L1细胞GLUT4表达水平及增加TG含量，提示Orexin A可能参与调控脂肪细胞的糖脂代谢。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 Orexin A及OX1R在高脂饮食诱导的肥胖胰岛素抵抗大鼠中表达的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 Orexin A及OX1R对脂肪细胞PPAR-γ2、GLUT4 mRNA表达和TG含量的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文三 Orexin A及OX1R调节脂肪细胞内ERK、JNK、p38信号通路蛋白的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 增食欲素(Orexin)在肥胖和胰岛素抵抗中的研究

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致谢

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