仙客来皂苷体外协同5-FU抗肿瘤作用机制研究

摘要

目的:研究仙客来皂苷(Cyclamin)单用或联合5-Fu体外诱导人肝癌细胞Bel-7402凋亡和坏死的作用及其分子机制。
　　方法:采用MTT比色法检测Cyclamin单用及联合5-Fu对人肝癌Bel-7402细胞的增值抑制作用;采用细胞划痕试验和体外侵袭小室试验证明Cyclamin抑制肿瘤Bel-7402细胞侵袭、转移;采用流式细胞术(FCM)分别观察常规化疗药物单用及联合Cyclamin处理Bel-7402细胞24小时和48小时后，对其细胞周期和凋亡变化的影响;进一步用免疫印迹(Western blot)法检测Cyclamin与5-Fu联用，对周期调控蛋白CDK2、CyclinA、CDC25A和细胞凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2表达水平的影响。
　　结果:Cyclamin抑制人肝癌Bel-7402细胞的增殖，且呈时间-剂量相关性;24h和48h时合用组（1.25μM Cyclamin+80μM 5-Fu）的抑制率分别为34.58±6.7％和54.88±5.5％，与5-Fu(80uM)单用时的体外生长抑制率30.98±9.6％、40.67±10.7％(24h、48h)比较有显著提高;联合指数（CI值）小于1。细胞划痕实验结果:对照组细胞24h、48h的相对迁移距离分别为80.1±2.7％和60.2±3.4％;2.5μM的Cyclamin实验组24h、48h的相对迁移距离分别为90.8±4.4％和82.1±5.6％，1.25μM的Cyclamin实验组48h的相对迁移距离是79.7±2.9％，与相应时间对照组迁移距离相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。体外侵袭实验结果:24h对照组穿膜细胞数为53.33±3.51;1.25μM和2.5μM Cyclamin实验组的穿膜细胞数分别为35.00±1.73、11.33±1.53，实验组与对照组相比，差异均有统计学意义(P＜0.05)。流式细胞术(FCM)结果显示:Cyclamin（0、1.25、2.5、5μM）处理Bel-7402细胞24h后，随着Cyclamin浓度的升高，S期细胞含量逐渐增多，在5.0μM浓度时，S期细胞含量是对照组的2.03倍，且出现明显的亚二倍体凋亡峰;5.0μMCyclamin的早、晚期凋亡率分别为7.4％和8.3％，随Cyclamin剂量增加，坏死细胞率依次为1.6％、2.7％、3.5％、5.9％，呈剂量相关性;Cyclamin(1.25μM)与5-Fu(80μM)分别并联合处理Bel-7402细胞，24h合用组S期细胞含量是52.75％，为对照组的2.22倍，且协同增加了5-Fu单用时的S期细胞含量(43.66％)。48h合用组S期细胞含量39.85％，为对照组的3.28倍，虽然略低于5-Fu单药组S期细胞数41.26％，但仅合用组出现明显亚二倍体凋亡峰。24h后合用组早期凋亡率为9.9％，比对照组(0.8％)及5-Fu单药组(6.2％)明显提高。48h合用组坏死细胞率达15.8％，与对照组(3.9％)及5-Fu单药组(4.4％)相比差异均有明显统计学意义(P＜0.01)。Western-blot蛋白免疫印迹实验结果表明:1.25μM的Cyclamin与80μM的5-Fu合用24h后CDK2和CDC25A的蛋白表达水平比对照组明显提高(P＜0.01)且高于任一单药组的表达，Bax/Bcl-2比值比对照组有明显增高。
　　结论:Cyclamin促进人肝癌细胞Bel-7402凋亡与坏死，抑制肿瘤细胞侵袭和转移，同时可协同5-Fu的抗肿瘤作用，机制与其改变周期和凋亡相关蛋白有关。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

材料与方法

一、材料与试剂

二、方法

实验结果

一、Cyclamin抑制Bel-7402细胞增殖

二、Cyclamin抑制肿瘤细胞侵袭和转移

三、低剂量Cyclamin协同增强化疗药物的抗肿瘤作用及CI值的计算

四、Cyelamin的抗肿瘤机制研究

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 三萜皂苷类化合物抗肿瘤活性的研究

致谢

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