人巨细胞病毒UL21.5多重转录本和UL4-UL5基因转录与mRNA结构研究

摘要

目的：
　　人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)先天感染可引起新生儿多种畸形和疾病。如黄疸性肝炎、智力低下、失明、耳聋等多器官、多系统病变。HCMV通常呈隐性感染，多数感染者仅为健康携带者，并无临床症状。只在少数免疫功能低下的人群，如AIDS、器官移植病人中会引发严重的HCMV感染，甚至导致死亡。目前，HCMV感染的致病机理尚不清楚。关于HCMV先天感染致病机理的研究已经成为儿科学和人类病毒学领域的一项重要课题。W.D.Rawlinson等发现了一个位于UL21基因互补链上的拼接转录本，后被命名为UL21.5。经研究发现，它是一个组装于病毒颗粒中的转录本，它所编码的UL21.5分泌蛋白可以选择性地与调节正常T细胞分泌和表达的RANTES结合，具有很高的亲和力，从而抑制RANTES介导的T细胞的活性。我们在一个HCMV晚期cDNA文库中随机筛选出一个具有内含子结构的cDNA克隆，其3'端与UL21.5转录本具有高度的同源性。采用cDNA文库筛选、Northern印迹杂交(Northern blot)、逆转录PCR(Reverse-Transcript PCR，RT-PCR)和快速cDNA末端扩增(Rapid amplification ofcDNA ends，RACE)等方法对该基因区域的转录本进行了深入研究，发现该区域能够转录由多个外显子转换拼接而产生的一组复杂转录本，将其命名为UL21.5多重拼接转录本(UL21.5 multiple spliced transcripts，UL21.5MST)。有学者发现，早期基因UL4具有3个不同的启动子来调节早期和晚期分别长约1.7、1.5和1.4kb的转录本。但本研究中所发现的UL4基因不局限于病毒感染的早期表达，在IE期也有表达。并且通过Northern Blot和RACE反复验证发现了一个单顺反子转录本UL5基因。本研究将以HCMV低传代临床分离株为研究对象，对UL4-UL5基因区域的基因转录情况进行深入研究。
　　材料和方法：
　　一、实验材料
　　标本为中国医科大学附属盛京医院病毒研究室保存的HCMV临床低传代分离株HAN株;MRC-5购自中科院上海细胞库;HCMV HAN株晚期cDNA文库为中国医科大学附属盛京医院病毒研究室构建和保存;采用DIG Northern StarterKit,3'-Full RACE Core Set Ver.2.0及5'-Full RACE Kit,Plasmid DNA PurificationSystem, Clean-Up with Wizard SV for Gel and PCR, TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0等实验试剂盒;引物合成及测序由Invitrogen公司完成;常用实验设备包括Beckman台式低温高速离心机、Bio-rad PCR循环仪、CO2培养箱等;所用数据库及分析软件包括基因组数据库、凝胶成像及扫描分析软件、引物设计软件、序列分析软件等
　　二、实验方法
　　（一）HCMV cDNA文库筛选
　　从HCMV HAN株晚期cDNA文库中筛选UL21.5、UL4-UL5特异性转录本。
　　（二）Northern blot
　　明确UL21.5、UL4-UL5基因转录本的表达时相及转录本长度;
　　（三）RT-PCR
　　进一步确认cDNA文库中发现的UL21.5的内含子结构，并且发现可能存在的新的转录拼接形式;
　　（四）3'及5'RACE(rapid-amplification of cDNA ends)
　　明确UL21.5、UL4-UL5基因转录本的3'及5'末端位置;
　　（五）体外模拟转录
　　通过构建重组载体进一步验证UL21.5MST拼接序列及内含子的真实性，并对调控拼接位点的机制进行探讨。
　　结果：
　　一、UL21.5MST基因转录本实验结果
　　（一）cDNA文库筛选
　　共筛选到34个cDNA阳性克隆序，3'末端均终止于参考株HCMV Towne株(FJ616285.1)的第27543个核苷酸位。其中25个序列具有与文献报道的UL21.5相同的拼接模式;5个序列与图1中的转录本Ⅰ结构相似;而5'端位于第24889位核苷酸的序列与图1中的转录本Ⅲ结构相似。
　　（二）Northern Blot
　　在晚期RNA标本中共检测到4簇分别长约400-600nt(nucleotide)，1250nt，1517nt和1900-2100nt的转录本。
　　（三）RT-PCR
　　发现由三个拼接受体位点和三个拼接供体位点互相排列而成的一组新的拼接转录本。
　　（四）RACE实验结果表明
　　UL21.5多重基因转录本具有相同的3'末端和不同的5'末端。同HCMVTowne株相比，3'末端位于第27543个核苷酸位，5'末端分别位于nt24835、nt24895、nt25220、nt25244、nt27040、nt27041和nt27043。通过序列分析后发现RACE和Northern Blot实验共鉴定出10种可能的转录本，长度分别为1955、1933、1566、1506、1179、1157、1530、1470、1143和1121个核苷酸。
　　（五）体外模拟转录
　　构建质粒pCMV-UL21.5MST进行体外模拟实验，检测到与之前RT-PCR结果一致的4个拼接转录本(Ⅰ-Ⅳ)。将突变质粒载体pCMV-UL21.5-mut-D1，pCMV-UL21.5-mut-A1，pCMV-UL21.5-mut-A2-3分别转染293细胞，得到的RNA标本进行RT-PCR实验经序列分析后分别发现拼接供体位点D1相关转录本Ⅲ和Ⅳ消失;拼接受体位点A1相关转录本Ⅱ和Ⅲ消失;拼接受体位点A2相关转录本Ⅳ消失。
　　二、 UL4-UL5基因转录本实验结果
　　（一）Northern Blot
　　检测到一个在感染三个时期均表达的长约1600-1800nt的高丰度转录本和一个仅在感染晚期表达的长约650nt的低丰度转录本。
　　（二）cDNA文库筛选结果
　　筛选到5个UL4基因克隆。测序结果显示:5个非拼接序列具有相同的3'末端，不同的5'末端。3'共末端位于第14750个核苷酸位。cDNA序列的5'末端分别位于nt13028，nt13226，nt13233，nt13328和nt13813，相对应的长度分别是1723bp,1525bp,1518bp,1423bp和938bp。
　　（三）RACE实验结果表明
　　UL4和UL5基因具有相同的3'末端，不同的5'末端。3'末端位于第14750个核苷酸位。UL5的5'末端分别位于nt14071和nt14188。在感染三期均检测到的UL4的2个5'端分别位于nt13229和nt13026，仅在感染的晚期检测到的5'端位于nt13328。根据3'RACE和5'RACE实验所获得的UL5和UL4全长转录本分别长为680nt,563nt,1522nt,1725nt和1423nt。
　　结论：
　　HCMV UL21.5MST在HCMV感染的晚期转录长为1250bp、1517bp、1900-2100bp的3个低丰度转录本和一簇长约400-600bp的高丰度转录本。UL21.5MST是由不同的3个拼接受体位点和3个拼接供体位点互相组合而成的一组转录本。通过突变实验确定1个拼接供体位点(D1)和2个拼接受体位点(A1和A2)的拼接调控区域，拼接调控分别位于参考株的第25531至25539，第26577至26596和第26621至26650个核苷酸位。
　　UL4-UL5基因转录一组3'共末端转录本。UL4基因在感染三期转录3种不同的转录本，其中长为1521bp和1725bp的转录本在IE期表达，长为1423bp的转录本仅在L期表达。UL5基因在感染的晚期转录一个长约563-670nt的单顺反子转录本。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 人巨细胞病毒UL21．5多重转录本基因转录和mRNA结构研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 人巨细胞病毒UL4-UL5基因转录和mRNA结构研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 人巨细胞病毒UL21／21a～UL21．5基因片段正负链基因转录和编码蛋白质能力的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

个人简介