肝素治疗脓毒症的效果评价及窖蛋白-1在其抗炎过程中的作用

摘要

脓毒症（sepsis）被定义为感染及其导致的全身炎症反应综合征(SIRS)，炎症反应的过度激活及免疫失衡是脓毒症的本质特征，因此，在脓毒症早期控制促炎因子的过度释放、恢复免疫平衡，从而达到保护器官功能，改善预后的目的，这已成为脓毒症研究的核心问题。
　　普通肝素(unfractioned heparin，UFH)抗凝效果确切，在临床上广泛应用于防治血栓栓塞性疾病、DIC的早期治疗。除此之外，肝素还具有广泛的抗炎作用，可明显降低炎症介质表达，降低凝血活化，保护内皮细胞完整性，从而可能降低脓毒症病人的多器官功能障碍的发生及病死率。而针对脓毒症病人的3个有关抗凝剂的大样本Ⅲ期临床试验的安慰剂组病例分析同样表明，肝素组较未应用肝素组似乎有更高的生存率。虽然近年来，临床应用肝素治疗脓毒症的随机对照实验开始出现，但针对其有效性及安全性的评估结果并不一致。
　　目前，肝素并未作为抗炎药物应用于临床，除了对其出血的不良反应的担忧，对其复杂抗炎机制的认识不足也是一个重要原因。肝素抗炎作用的机制和确切作用位点尚不完全清楚。作为带负电荷的大分子物质，肝素通过胞吞作用进入细胞内十分缓慢，低浓度时甚至尚未形成完成的囊泡便已被降解代谢。有证据表明，低至1μg/ml的肝素可在2分钟以内通过调控细胞表面的Erk及钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaMK)活化产生作用，而与细胞内蛋白激酶R的直接结合作用需要100μg/ml的肝素72小时以后才能发挥作用。因此，低剂量肝素的效果至少部分应作用于细胞外。
　　胞膜窖是细胞膜上富含胆固醇和鞘磷脂的壶腹状凹陷，参与了广泛的细胞作用过程。窖蛋白是胞膜窖的外壳蛋白，属于嵌膜蛋白质(integral membrane protein)家族成员，在不同的细胞中有些特定的功能，而窖蛋白-1(caveolin-1，Cav-1)可能是体内炎症细胞潜在的重要免疫调节分予，并且在炎症信号传导过程中处于轴心位置，这其中包括巨噬细胞。有文献报道，不同免疫细胞所表达的Cav-1在感染或炎症反应中发挥了极其重要的调节作用。
　　有趣的是，有文章报道，肝素能够调控Cav-1的表达和亚细胞定位，然而在炎症过程中，他们之间是否存在相关性尚未被证实。揭示Cav-1参与炎症反应中的调控机制能够进一步理解Cav-1的功能，以帮助我们寻找治疗与炎症相关疾病新的靶点。
　　材料和方法:
　　一、研究对象
　　论文一针对肝素治疗脓毒症病人的有效性及安全性进行系统综述，通过计算机检索MEDLINE数据库、Cochrane图书馆、科学引文索引扩展板数据库(SCIE)、中国生物医学文献数据库(CBM)、中国知识基础设施工程数据库(CNKI)、维普数据库、万方数据库，检索时限均从2000年1月至2012年6月，纳入肝素治疗脓毒症的随机对照临床试验17个，共1167例脓毒症病人。
　　论文二、论文三及中实验用小鼠腹腔巨噬细胞均分离自未注射刺激物的C57BL/6小鼠。
　　二、实验材料
　　DMEM培养基、PBS、FBS、LPS、普通肝素、SB203580、NP-40裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒、一抗二抗去除液、TEMED、预染蛋白分子量标准、PVDF膜、ECL发光液、BSA、脱脂奶粉、羊抗小鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP、Mouse antiβ-actin-HRP、胎牛血清、脂质体2000、Super M-MLV反转录酶、RNAsimple Total RNA Kit、RNase固相清除剂、Powder琼脂糖、50×TAE、2×Power TaqPCR MasterMix、SYBR Green、小鼠TNF-α、IL-6、IL-8及IL-1β ELISA检测试剂盒。
　　三、实验方法
　　（一）筛选所有符合纳入标准的肝素治疗脓毒症的RCT研究，并采用Cochrane系统评价员手册5.1.0推荐的质量评价方法对其进行质量评价，对28天病死率、出血、凝血指标变化、住院时间、病情改善及器官保护进行数据提取，采用Revman5.1进行系统评价。
　　（二）ELISA检测炎症因子蛋白表达情况;Western blot检测caveolin-1蛋白及MAPK信号分子蛋白表达;siRNA转染下调caveolin-1表达;RT-PCR检测caveolin-1及炎症因子mRNA转录情况。
　　四、统计学分析
　　论文一统计学分析采用Revman5.1软件完成。结果数据以均值±标准差表示，所有原始数据使用单向方差分析进行(ANOVA)，然后通过Bonferroni检验进行多组两两比较。P＜0.05认为具有统计学意义。
　　结果:
　　一、肝素治疗脓毒症的有效性及安全性
　　1、与对照组相比，肝素能显著降低脓毒症患者28天病死率，其差异具有统计学意义[OR=0.59，95 CI(0.45，0.77)，P=0.0001]。
　　2、小剂量肝素治疗的病例中严重出血发生率很低。
　　3、肝素治疗未导致血小板计数明显下降，相反有助于纠正血小板降低[MD=13.94，95 CI(10.15，17.72)，P＜0.00001]，肝素对PT及APTT影响与对照组无统计学差异。
　　4、肝素对病人住院时间无明显影响，但可缩短住ICU时间[MD=-4.43，95 CI(-6.79,-2.07),P=0.0002]。
　　5、肝素治疗后脓毒症病人APACHEⅡ评分明显降低[MD=-2.58，95 CI(-3.29，-1.87)，P＜0.00001]，MODS发生率明显降低[OR=0.32，95 CI(0.17，0.61)，P=0.0006]。
　　二、肝素通过p38 MAPK通路抑制脂多糖诱导的小鼠腹腔巨噬细胞炎症细胞因子转录与表达
　　1、与对照组相比，100ng/ml LPS可诱导小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β浓度分别增高2.74，4.30，4.04和4.54倍，mRNA转录分别增高2.28，2.52，1.99和2.84倍。
　　2、与单纯LPS刺激组比较，同时加用20μg/ml肝素能够使TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β浓度分别降低37.4，45.5％，42％和35.7％，mRNA转录水平也相应被抑制36％，35.7％，36.7％和44.4％，单纯加用肝素对TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β浓度及mRNA转录均无明显影响。
　　3、与对照组相比，100ng/ml LPS刺激下，巨噬细胞p-ERK、p-JNK、p-p38浓度明显升高1.66，1.94和2.72倍，但ERK，JNK和p38 MAPK均无明显变化。与单纯LPS刺激组比较，同时加用20μg/ml肝素能够使p-p38上升1.56倍，却使p-JNK下降41.3％，而对p-ERK无明显影响。
　　4、与LPS+DMSO组相比，同时加用肝素能够使TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β浓度分别降低41.7％，52.2％，44.1％，41.9％;与LPS+DMSO+肝素组比较，LPS+肝素+SB203580组TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β浓度明显增高(p＜0.05)，与LPS+DMSO组无统计学差异(p＞0.05)，SB203580明显减弱了肝素抑制炎症因子表达的作用。
　　三、caveolin-1是肝素抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞炎症细胞因子表达的关键分子
　　1、成功构建siRNA介导caveolin-1低表达巨噬细胞，与阴性对照及正常对照巨噬细胞相比，caveolin-1蛋白及mRNA表达分别下降75％和80％。
　　2、阴性对照及Cav-1低表达巨噬细胞在LPS诱导下，炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β浓度均明显升高，而且Cav-1低表达巨噬细胞炎症因子表达水平比阴性对照细胞更高，然而，后者能够被肝素明显抑制，而前者却不明显。单独给予肝素对转染的巨噬细胞炎症因子表达无明显影响。
　　3、在等量肝素作用下，p-p38 MAPK在正常及阴性对照巨噬细胞的表达无差异，而在Cav-1低表达巨噬细胞表达下降49％。
　　结论:
　　1、小剂量肝素可降低脓毒症病人的病死率，改善预后，且安全性较高。
　　2、LPS诱导上调小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β转录及蛋白表达，而肝素对其有明显抑制作用。
　　3、LPS可诱导小鼠腹腔巨噬细胞MAPK信号通路激活，肝素通过调控p38MAPK磷酸化发挥抗炎作用。
　　4、Cav-1是肝素通过p38 MAPK信号通路发挥抗炎作用的关键分子。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 肝素治疗脓毒症的系统评价

前言

研究材料及方法

结果

讨论

结论

论文二 肝素通过p38 MAPK通路抑制脂多糖诱导的小鼠腹腔巨噬细胞炎症细胞因子转录与表达

前言

研究资料与方法

结果

讨论

结论

论文三 窖蛋白-1是肝素抑制脂多糖诱导的小鼠腹腔巨噬细胞炎症细胞因子表达的关键分子

前言

研究材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 胞膜窖及窖蛋白-1在脓毒症中的作用

在学期间科研成绩

致谢

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