缺氧预处理骨髓间充质干细胞鞘内移植对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的作用及其机制的研究

摘要

研究背景:
　　脊髓缺血再灌注损伤(SCIRI)是胸腹主动脉手术常见的并发症。脊髓缺血再灌注预后较差，常导致瘫痪或者死亡，给患者及家属带来沉重负担。因此，寻找有效的预防措施对于改善脊髓缺血再灌注损伤的预后具有重要意义。
　　目前临床上对于SCIRI的治疗措施包括外科手术、药物治疗、基因治疗和移植治疗等，然而外科手术治疗的关键时间点难以把握;药物治疗的进展不大，目前并无明显的特效药的普遍应用;基因治疗尚处于探索阶段;而干细胞移植和外周神经移植是后期治疗脊髓严重损伤的一种比较有希望的方法。近年来，细胞移植技术在多种组织及器官损伤的修复中得到广泛应用。已有多项研究证实BMSCs移植能够有效地减轻SCIRI。然而细胞移植后在缺血组织中出现大量凋亡，严重影响了治疗效果。尽管目前移植细胞死亡的原因仍不十分清楚，但缺血组织的血供不足、低氧、炎性反应、氧化应激以及细胞毒性物质积累都对移植细胞的存活造成不利影响。因此，如何减少BMSCs移植后的凋亡，提高BMSCs在体内的存活率是目前干细胞移植亟待解决的问题。
　　目前，多项体外研究已经证实缺氧预处理能够提高间充质干细胞对缺氧环境的适应性，提高细胞活性并且抑制细胞的凋亡。体内研究也指出移植之前在体外进行缺氧预处理能够有效提高骨髓间充质干细胞的活性以及组织修复能力。研究发现缺氧预处理能够显著提高骨髓间充质干细胞的活性、趋化能力，促进神经营养因子分泌，并能够提高移植后骨髓间充质干细胞对肾缺血再灌注损伤、心肌缺血再灌注损伤、脑损伤等的保护作用。
　　然而，关于缺氧预处理能否提高BMSCs对SCIRI的保护作用及其机制尚未见报道。故而，本研究通过提取经缺氧预处理的BMSCs，并将其移植到SCIRI的脊髓组织中来探讨缺氧预处理后的BMSCs对SCIRI保护作用，以期为BMSCs对SCIRI的保护作用的高效完成提供新的思路。基于以上研究背景，我们推测缺氧预处理能够提高间充质干细胞在移植后的活性，促进其对缺血再灌注损伤的保护作用。
　　研究方法:
　　1.实验动物
　　健康成年SD大鼠60只，体重200-250 g，购于中国医科大学动物实验中心。
　　2.实验方法
　　2.1提取、培养、鉴定、缺氧预处理大鼠BMSCs。
　　2.2实验分组
　　SD大鼠随机分为5组，每组12只。
　　Sham组:拟行单纯手术操作不进行缺血再灌注;
　　I/R组:只进行缺血再灌注处理;
　　NP-BMSC组:在脊髓缺血再灌注损伤前鞘内注射未预处理的BMSC;
　　HP-BMSC组:在脊髓缺血再灌注损伤前鞘内注射缺氧预处理的BMSC;
　　PBS组:在缺血再灌注鞘内注射等量PBS。
　　2.3建立大鼠缺血再灌注损伤模型
　　3.观察指标
　　3.1改良Tarlov评分标准神经功能评分
　　3.2荧光标记观察移植BMSCs在体内的迁移、分布
　　3.3伊文思蓝血脊髓屏障完整性检测
　　3.4HE染色检测脊髓组织的病理学变化
　　3.5TUNEL检测脊髓组织的细胞凋亡情况
　　3.6Real-time PCR检测脊髓组织中HIF-1α mRNA的表达
　　3.7Western blot检测脊髓组织中HIF-1α蛋白的表达
　　实验结果:
　　4.1神经功能评分
　　每组大鼠分别于术后6h、12 h、24 h、48 h、7d进行神经功能评分，结果显示与PBS组相比，HP-MSCs组和NP-MSCs组均能够提高神经功能评分;且HP-MSCs组的评分显著高于NP-MSCs组。
　　4.2荧光标记观察移植BMSCs在体内的迁移、分布
　　BMSCs经CFSE和DAPI双标记后，胞浆为绿色，胞核为蓝色，界限清晰。48h和7d后，HP-MSCs组移植存活的BMSCs细胞数目均明显多于NP-MSCs组。
　　4.3伊文氏蓝染色来检测每组大鼠血脊髓屏障的完整
　　I/R组大鼠BSCB严重损害，HP-MSCs组和NP-MSCs组伊文氏蓝渗透则明显减弱，且HP-MSCs组脊髓损伤组织伊文氏蓝浓度显著低于NP-MSCs组BMSCs。
　　4.4HE染色检测大鼠损伤脊髓的病理变化
　　I/R组和PBS组的脊髓损伤比较严重，NP-MSCs组和HP-MSCs组核碎裂少见，损伤明显较轻，HP-MSCs组的组织形态更接近于正常脊髓组织。
　　4.5TUNEL染色检测脊髓组织细胞凋亡
　　与sham组相比，I/R组和PBS组的细胞凋亡数目更多，而NP-MSCs组的凋亡细胞数目显著减少。同时HP-MSCs组的凋亡细胞数目又显著低于NP-MSCs组。
　　4.6Real-time PCR检测脊髓组织中HIF-1α的表达
　　与I/R组相比，NP-MSCs组和HP-MSCs组HIF-1α mRNA表达水平明显增加，并且HP-MSCs组HIF-α又显著高于NP组。
　　4.7Western blot检测脊髓组织中HIF-1α蛋白的表达Western blot的结果证实与I/R组相比，NP-MSCs组HIF-1α蛋白的表达明显增加，同时HP-MSCs组HIF-1α蛋白的表达又显著高于NP组。
　　实验结论:
　　研究结果证实，缺氧预处理确实能够有效提高移植后骨髓间充质干细胞的存活率，通过增强神经保护，修复细胞功能，保护血脊髓屏障等方面提高移植后骨髓间充质干细胞对脊髓缺血再灌注损伤的保护作用，这可能与缺氧条件下HIF-1α的表达上调有关。

目录

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摘要

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结果

讨论

结论

本研究创新性自我评价

参考文献

综述 脊髓缺血再灌注损伤保护机制的研究进展

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