白藜芦醇对高脂饮食诱导的C57BL/6J小鼠骨性关节炎模型干预效果研究

摘要

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是以关节软骨进行性损害为主要特征的慢性关节疾病。OA的病因和发病机制尚未完全阐明，但肥胖是OA危险因素之一。肥胖患者体重增加不仅通过增加膝关节负荷导致膝关节OA，同时改变膝关节生物学机制，从而进一步导致OA发发展。在研究肥胖参与OA的发病机制时，利用高脂饮食诱导小鼠发生OA，可能是研究肥胖与OA关系的有效方法。
　　OA为退行性病变，其发生发展过程为不可逆，所以能够早期发现和预防OA发生尤为重要。白藜芦醇（resveratrol，RES）作为一种天然的多酚类化合物，具有抗氧化、抗炎性、抗衰老、抗凋亡和调节糖脂代谢等多种作用。许多体外及体内研究结果均表明RES可以拮抗OA的发生发展，但其作用机制并未完全阐明。
　　目的：
　　本研究拟利用高脂饮食诱导C57BL/6J小鼠发生肥胖的方法建立OA动物模型，通过血清学、病理学、软骨细胞凋亡来判定OA的发生情况;同时进行不同剂量RES干预，观察RES对OA的干预效果，为探讨OA与肥胖的关系及OA的营养防治措施提供实验依据。
　　方法：
　　一、动物的分组
　　将60只C57BL/6J雄性小鼠，适应性喂养一周后按体重随机分为对照组、高脂组、RES低剂量干预组（低剂量组）、RES中剂量干预组（中剂量组）及RES高剂量干预组（高剂量组），每组12只，对照组喂食基础饲料，高脂组和干预组喂食高脂饲料。
　　二、动物处理及样品采集
　　对照组和高脂组给予0.5％羧甲基纤维素钠(CMC)水溶液灌胃。干预各组给予0.5％CMC与RES悬浊液灌胃，其中低剂量组RES干预剂量为5mg/kg/d;中剂量组RES干预剂量为22.5mg/kg/d;高剂量组RES干预剂量为45mg/kg/d。各组小鼠均自由进食和饮水，每周称重，共计12周。
　　实验结束后收集小鼠血清，-80℃保存备用。取小鼠左下肢膝关节，固定、脱钙后进行石蜡包埋，切5μm组织切片备用。
　　三、检测指标
　　（一）体重
　　（二）血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)水平采用酶偶联比色法检测。
　　（三）血清Ⅱ型胶原C端肽(CTX-Ⅱ)水平采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测。
　　（四）软骨组织形态学观察
　　对各个组织切片行HE染色、番红O染色和番红O-固绿染色，并利用双盲法对其进行Mankin评分。
　　（五）软骨组织Ⅱ型胶原蛋白表达
　　利用免疫组化方法，检测各组小鼠膝关节软骨组织Ⅱ型胶原蛋白的表达，并利用ImageJ2x软件进行平均灰度值测量。
　　（六）软骨组织细胞凋亡情况
　　利用TUNEL法检检测软骨组织细胞凋亡情况，计数各组织切片凋亡细胞数。
　　四、数据处理和统计分析
　　用SPSS19.0统计软件进行数据分析，结果用(x)± SE表示，方差分析方法进行组间比较。检验水准为α=0.05。
　　结果：
　　一、小鼠体重变化状况
　　实验期间，各组小鼠一般状况良好，生长发育未见异常。高脂组小鼠体重高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01）;各干预组小鼠体重低于高脂组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　二、小鼠血清TG、TC水平
　　高脂组血清TG水平均高于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.01);中剂量组血清TG水平低于高脂组，差异具有统计学意义(P＜0.05);高脂组血清TC水平均高于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.01)。
　　三、小鼠血清CTX-Ⅱ水平
　　高脂组血清CTX-Ⅱ含量高于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05);各干预组中，高剂量组血清CTX-Ⅱ含量低于高脂组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　四、小鼠软骨组织形态学评价
　　HE染色下观察，对照组软骨细胞排列整齐，软骨组织表面平整，软骨组织基质染色正常。高脂组软骨细胞或减少或局部增加，且排列较为混乱，基质染色不均匀。各干预组软骨细胞偶有增生或减少，排列不规则，各干预组间比较无明显差异。
　　对照组软骨组织在番红O染色下潮线界线较为清晰、完整，无缺失现象。高脂组软骨组织可见潮线缺失，颜色变浅等现象。干预各组偶见潮线缺失，各干预组间比较无明显差异。
　　番红O-固绿染色显示对照组软骨组织较为完整及宽厚，软骨与骨之间分界较清。高脂组可见软骨组织出现破损情况，有些组织也较为扁薄。各干预软骨与骨之间界线清楚，偶有软骨组织缺失，各干预组之间比较没有明显差异。
　　Mankin评分及发病率结果显示高脂组均最高，与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。干预组Mankin评分及发病率与高脂组比较有不同程度下降，但无统计学意义（P＞0.05）。
　　五、小鼠软骨组织Ⅱ型胶原免疫组化染色结果
　　对照组软骨细胞染色较深，基质与细胞分界清晰。高脂组软骨细胞明显减少，染色较浅，基质和细胞分界不清。各干预组软骨细胞染色较为清晰。与对照组比较，高脂组平均灰度值较低，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。干预各组与高脂组比较，平均灰度值均有不同程度升高，但无统计学意义(P＞0.05)。
　　六、小鼠关节软骨组织细胞凋亡情况
　　高脂组与对照组比较，软骨组织中的黄绿色颗粒多于对照组，在软骨组织各个分层中都有分布。高脂组细胞凋亡率高于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。各干预组与高脂组比较，软骨组织中的黄绿色颗粒有不同程度减少，其中以中剂量最为明显，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论：
　　1.利用高脂饮食可以诱导C57BL/6J小鼠发生OA。
　　2.RES可以抑制高脂饮食诱导的C57BL/6J OA小鼠软骨基质降解，使血清CTX-Ⅱ水平降低，以高剂量45mg/kg/d的效果最明显。
　　3.RES可以抑制高脂饮食诱导的C57BL/6J OA小鼠软骨细胞凋亡，以中剂量22.5mg/kg/d的效果最明显。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 骨性关节炎动物模型建立及治疗研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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