整合素α4在骨髓间充质干细胞向胶质瘤迁移过程中的作用及其相关机制研究

摘要

目的：
　　作为人类中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，胶质瘤由于其侵袭性生长方式，易发生脑内转移的特点，即使采用了手术辅以放、化疗的综合治疗方案，患者预后仍然不理想。近年来，越来越多的学者对胶质瘤的治疗提出了新的方案——靶向性基因治疗。靶向性基因治疗是在某一载体中导入功能基因，并对肿瘤细胞进行靶向定位，从而定向攻击肿瘤细胞。目前在靶向性基因治疗研究中最受研究者关注的问题之一是如何选择合适的载体。继以病毒载体之后，有研究报道可以利用干细胞的趋瘤特性将其作为治疗性基因的载体。间充质干细胞(mesenchymalstem cells，MSCs)是一种来源于中胚层的成体干细胞。因MSCs具有组织来源多样和向胶质瘤定向迁移的特点，使其可能成为胶质瘤靶向治疗较为理想的载体。在众多来源的MSCs中，骨髓来源的间充质干细胞(BMSCs)因其可自体取材，易于体外扩增等特点而得到越来越多研究者的青睐。Integrinα4作为整合素家族的一个成员，可以在细胞迁移过程中发挥重要的作用，并且已被证实参与调控白细胞等免疫细胞跨内皮迁移。
　　本研究中我们首先建立大鼠骨髓间充质干细胞体外培养体系并对所获得细胞的表面标志物和多向分化能力进行鉴定;其次利用伤痕愈合实验和Transwell体外迁移模型来研究BMSCs向胶质瘤细胞定向迁移以及integrinα4在这一过程中的作用;并进一步运用聚合酶链式反应(PCR)、免疫荧光、蛋白免疫印迹(westernblot)技术研究胶质瘤条件培养基对BMSCs表达integrinα4的影响;最后利用PI3K，NF-κB，MEK，p38MAPK和JNK信号通路的特异性抑制剂探讨调控胶质瘤诱导BMSCs对integrinα4表达变化以及BMSCs定向迁移过程中所可能涉及的相关信号转导机制。
　　实验材料和方法：
　　一、实验材料
　　1、主要试剂:
　　DMEM低糖培养基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，兔抗大鼠CD34、CD45、CD73、CD90、CDl05多克隆抗体（北京博奥森），integrinα4单克隆抗体(Abcam)，75cm2培养瓶和Transwell小室(Corning)。SB203850(Enzo)，LY294002(CellSignalingTechnology),SP600125(Enzo), PD98059(Enzo)及BAY11-7082(Enzo),TRizol(Life technologies), RNA PCR Kit(AMV) ver3.0(TaKaRa), SYBR PremixEx TaqTMII Kit(TaKaRa)。罗丹明标记的山羊抗兔荧光二抗（北京博奥森），RIPA裂解液(Sigma)，小鼠抗大鼠GAPDH单克隆一抗(Santa Cruz)，山羊抗小鼠HRP二抗(Santa Cruz)。Transwell小室(聚碳酸酯膜，孔径为8μm，型号3422，ComingCostar)。ECL化学发光试剂盒(Thermo Scientific)。
　　2、实验动物
　　BMSCs培养原代取材使用4-6周龄健康雌性SD大鼠，体重60-80g，由中国医科大学实验动物部提供。
　　3、主要仪器
　　细胞培养箱（美国Forma scientific公司）;超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）;倒置显微镜（日本TMS公司）;荧光显微镜（日本Olympus公司）;紫外-可见光分光光度计（日本岛津公司）;FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）;超声粉碎机（德国Hielscher公司）;台式低温超速离心机（美国Sigma公司）;聚丙烯酰胺凝胶电泳装置（美国Bio-Rad公司）;转印仪（北京市六一仪器厂）;Las3000成像系统（日本Fujifilm公司）;凝胶成像分析软件（江苏捷达科技有限公司）;电子分析天平（德国Sartorius公司）;-80℃超低温冰箱（日本Sanyo公司）;恒温震荡水浴（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）;旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）。
　　二、实验方法
　　1、全骨髓贴壁法分离培养BMSCs。
　　2、流式细胞术鉴定BMSCs细胞表面标记物。
　　3、鉴定原代培养获得的BMSCs具有向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的能力。
　　4、利用Transwell小室建立体外迁移模型评价BMSCs向胶质瘤的定向迁移。
　　5、伤痕愈合实验评价胶质瘤条件培养基孵育对BMSCs迁移能力的影响。
　　6、RT-PCR和免疫荧光法评估integrinα4在BMSCs的表达。
　　7、MTS检测胶质瘤条件培养基对BMSCs增殖的影响。
　　8、胶质瘤条件培养基孵育BMSCs24小时后，利用RT-PCR、免疫荧光及western blot检测integrinα4表达的改变。
　　9、流式细胞术检测胶质瘤条件培养基对BMSCs细胞周期的影响。
　　10、体外迁移模型评估integrinα4在BMSCs向胶质瘤迁移过程中的作用。
　　11、胶质瘤条件培养基孵育同时分别加入SB203850（10μM），LY294002（30μM），SP600125（10μM），PD98059（10μM）及BAY11-7082（5μM），RT-PCR及western blot测定上述抑制剂对胶质瘤条件培养基诱导BMSCs表达integrinα4变化的影响。
　　12、胶质瘤条件培养基孵育同时加入BAY11-7082（5μM），利用Transwell体外迁移模型和伤痕愈合实验模型评估BAY11-7082对BMSCs向胶质瘤迁移能力的影响。
　　13、数据分析采用SPSS19.0软件。所有实验数据用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较用One-way ANOVA检验，P＜0.05有统计学差异。
　　结果：
　　一、大鼠BMSCs的分离鉴定
　　1、原代培养骨髓细胞4天后，镜下可见贴壁细胞;P1，P2，P3代细胞可见细胞呈长梭形，旋涡状生长。
　　2、经流式细胞仪检测发现原代培养所获得的P3代BMSCs CD34(阳性率1％)，CD45（阳性率0.966％）表达呈阴性，同时CD73（阳性率98.7％），CD90（阳性率99.1％），CD105（阳性率98.3％）表达呈阳性。
　　3、用P3代BMSCs进行成骨，成脂，成软骨三系分化实验。诱导分化后的BMSCs分别对矿结节染色、脂肪油滴染色和胶原蛋白染色呈阳性表达，证实所获得的BMSCs具有向成骨细胞，脂肪细胞，软骨细胞分化的能力。
　　二、阻断integrinα4抑制BMSCs向胶质瘤的定向迁移
　　1、伤痕愈合实验结果显示在胶质瘤条件培养基孵育下BMSCs迁移能力明显增强。
　　2、Transweil体外迁移模型中，在下室内加入胶质瘤条件培养孵育，BMSCs可以发生定向迁移，证实BMSCs具有向胶质瘤定向迁移的能力。
　　3、Integrinα4单克隆阻断抗体明显抑制了BMSCs向胶质瘤的定向迁移。
　　三、胶质瘤条件培养基上调BMSCs对integrinα4的表达
　　1、RT-PCR证实胶质瘤条件培养基促进BMSCs对integrinα4 mRNA的表达
　　2、免疫荧光实验结果显示胶质瘤条件培养基可以上调BMSCs对integrinα4的表达。
　　3、Western blot证实胶质瘤条件培养基明显增加了BMSCs对integrinα4的表达
　　四、NF-κB，PI3K通路参与由胶质瘤条件培养基诱导的BMSCs对integrinα4上调表达过程的调控
　　1、NF-κB和PI3K通路抑制剂可以明显抑制胶质瘤条件培养基诱导BMSCs对integrinα4的上调表达。
　　2、JNK、p38MAPK、MEK通路抑制剂对胶质瘤诱导的integrinα4上调表达无明显抑制作用。
　　五、NF-κB是调控BMSCs向胶质瘤定向迁移的相关信号分子
　　伤痕愈合实验、Transwell迁移模型实验结果提示NF-κB通路抑制剂BAY11-7082可以明显减弱BMSCs向胶质瘤的迁移。
　　结论：
　　1、Integrinα4参与了BMSCs向胶质瘤定向迁移过程的调控，胶质瘤条件培养基孵育可以增强BMSCs对integrinα4的表达。
　　2、NF-κB与PI3K信号通路参与了胶质瘤诱导BMSCs对integrinα4表达改变的调控。
　　3、NF-κB是调控BMSCs向胶质瘤定向迁移的相关信号分子。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 MSCs的胶质瘤定向迁移能力及其机制

在学期间科研成绩

致谢

个人简介